Визуализация дендритных шипов при Caenorhabditis elegans
27 сентября 2021 г.
Дендритные шипы являются важными клеточными особенностями нервной системы. Здесь описаны методы визуализации в реальном времени для оценки структуры и функции дендритных шипов у C. elegans. Эти подходы поддерживают разработку мутантных экранов для генов, которые определяют форму или функцию дендритного позвоночника.
Этот протокол описывает методы визуализации дендритных морфологий позвоночника и переходных процессов кальция в нейронах C.elegans. Наш подход должен способствовать генетическим подходам к обнаружению детерминант морфогенеза и функции позвоночника. Наш протокол включает дендритные шипы в ГАМКергических нейронах.
Шипы в других классах нейронов C.elegans также могут быть исследованы с помощью этих методов. Наш протокол описывает методы иммобилизации живых C.elegans. Особенно важно предотвратить движение животных во время получения изображения и выбрать правильные лазерные конфигурации для возбуждения и записи активности нейронов.
Чтобы получить изображения с высоким разрешением, добавьте три микролитра раствора анестетика и обобщите от 15 до 20 молодых взрослых червей на 10% агарозных подушечках. Затем нанесите крышку, чтобы обездвижить червей, и запечатайте края крышки расплавленной клейкой герметизирующей смесью. Для получения сверхвысокого разрешения используйте лазерный сканирующий конфокальный микроскоп, оснащенный микроскопией сверхвысокого разрешения.
Приобретайте Z-стеки, используя размер шага, рекомендованный программным обеспечением производителя. Соберите серию оптических секций, которые охватывают общий объем дорсального D или DD вентрального процесса. Отправляйте Z-стеки для обработки изображений с помощью программного обеспечения производителя и анализируйте изображения с оценкой выше семи.
Для получения Найквиста используйте лазерный сканирующий конфокальный микроскоп и выберите оптимальный размер пикселя для длины волны света и числовой диафрагмы объектива. Затем отправьте стек для 3D-деконволюции с помощью автоматического алгоритма. Для анализа изображений используйте соответствующее программное обеспечение для обработки изображений для создания проекций максимальной интенсивности стеков Z.
И вручную подсчитать выступы на дендрите DD. Затем определяют длину набранного дендрита DD для расчета плотности шипов на 10 микрометров дендрита DD. Затем классифицируйте колючки как тонкие или грибные, филоподиальные, корявые или разветвленные.
Используя обычные методы, такие как микроинъекция, создают трансгенных червей, экспрессирующих датчик кальция GCaMP в нейронах DD, и Chrimson, родопсин с красным смещением в пресинаптических нейронах VA. Затем, под ламинарной вытяжкой, подготовьте все трансретинальные или ATR пластины, добавив 300 микролитров выращенной ночью бактериальной культуры OP50 и 0,25 микролитра ATR к каждой 60-миллиметровой питательной агаровой пластине нематодной среды. Затем выкладываем культуру стерильным стеклянным стержнем.
Для контрольных пластин добавьте 300 микролитров бактерий OP50 и 0,25 микролитра этанола. Чтобы обеспечить рост бактерий, инкубируйте пластины при комнатной температуре в течение 24 часов, защищенные от окружающего света. Чтобы начать эксперимент, поместите пять личинок стадии L4 на OP50-засеянные ATR или контрольные пластины и инкубируйте пластины в темноте при 23 градусах Цельсия.
Через три дня используйте стереопарирующий микроскоп для подтверждения развития вульвы и выберите потомство стадии L4 из ATR и контрольных пластин для визуализации. Затем поместите два микролита полигранул размером 0,05 микрометра на предметное стекло микроскопа. И поместите в раствор примерно 10 личинок L4.
Используя платиновую проволоку, добавьте в раствор небольшую шарик суперклея. Осторожно закрутите раствор, чтобы образовать нитевидные нити клея. Затем добавьте три микролитра буфера M9.
Затем нанесите крышку и запечатайте ее края, как показано ранее. Чтобы записать вызванные переходные процессы кальция в дендритных шипах, используйте вращающийся дисковый конфокальный микроскоп и отрегулируйте стадию микроскопа, чтобы расположить шипы DD в фокальной плоскости. Затем настройте покадровое получение для освещения образца 488-нанометровой лазерной линией в каждом кадре для обнаружения флуоресценции GCaMP и 561-нанометровой лазерной линией с периодическими интервалами для возбуждения Кримсона.
Для визуализации кальция in vivo используйте 2D-деконволюцию и выравнивание изображения для коррекции незначительных отклонений от движения червя во время захвата. Затем определите дендритный позвоночник DD как область интереса или ROI. Продублируйте ROI и переместите его в соседний регион внутри червя, чтобы собрать фоновый сигнал.
Затем, используя соответствующее программное обеспечение, экспортируйте интенсивность GFP в Excel для каждой точки времени и вычтите фоновую флуоресценцию из флуоресценции ROI позвоночника. Определите изменение флуоресценции, вычитая флуоресценцию GFP в кадре непосредственно перед 561-нанометровым возбуждением или при нуле из каждой точки времени после возбуждения или дельты F. Затем разделите на F ноль, чтобы определить дельту F над F нулем. И график нормализованных следов.
Во-первых, определите, обычно ли данные распределены, используя тест Шапиро-Уилка. Для данных, которые обычно не распределяются, используйте непараметрическую ANOVA с пост-специальной коррекцией для многократного тестирования. В качестве альтернативы, для измерений, показывающих нормальное или гауссово распределение, выполняют парный параметрический тест ANOVA для каждого измерения флуоресценции GCaMP до и после каждого 561-нанометрового импульса.
И правильно для нескольких сравнений в каждой из двух групп. Маркировка дендритных шипов DD с тремя независимыми маркерами, цитозольной mCherry, MYR: mRuby и LifeAct: GFP дала среднюю плотность 3,4 дендритных шипов DD на 10 микрон дендрита DD у молодых людей дикого типа. Маркер GFP: Utrophin был исключен из этого анализа, потому что он дал значительно более низкую плотность позвоночника, потенциально из-за взаимодействия утрофина с актиновым цитоскелетом, который управляет морфогенезом позвоночника.
Подход к визуализации живых клеток подтвердил, что тонкая грибовидная морфология шипов DD преобладает у взрослого человека по сравнению с альтернативными формами позвоночника, такими как филоподиальная, короткая и разветвленная. Активация дендритных шипов DD оценивалась пресинаптической холинергической сигнализацией у трансгенных червей, экспрессирующих GCaMP в нейронах DD, и Chrimson в пресинаптических нейронах VA. Переходные всплески сигнала GCaMP были обнаружены в позвоночниках DD сразу после оптогенетической активации Хримсона в пресинаптических нейронах VA.
Контрольный эксперимент в отсутствие ATR подтвердил, что измерение сигнала GCaMP зависит от оптогенетической активации Хримсона, которая строго зависит от ATR. Чтобы визуализировать шипы DD, лучше всего изобразить животных, лежащих на боку, таких как шипы, которые выступают, находятся под прямым углом к световому пути. С помощью этого метода ученые также могут использовать фармакологические манипуляции, чтобы понять механизмы, которые управляют переходными процессами кальция в позвоночниках DD.
Обзор
В данном исследовании представлены методы визуализации в режиме реального времени для изучения морфологии дендритных шипиков и кальциевых транзиентов в нейронах C. elegans. Описываемые методы призваны облегчить применение генетических подходов для выявления факторов, определяющих морфологию и функцию дендритных шипиков, с особым вниманием к ГАМК-ергическим нейронам. Основные результаты указывают на преобладание тонких грибовидных шипиков у взрослых особей.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Визуализация живых объектов
- Генетический анализ
Теоретическая часть
- Дендритные шипики являются жизненно важными клеточными структурами нервной системы.
- C. elegans служит модельным организмом для изучения особенностей нейронов.
- Понимание морфологии шипиков имеет решающее значение для понимания функций нейронов.
Цель исследования
- Описать методы визуализации дендритных шипиков у C. elegans.
- Обеспечить проведение генетических скринингов для идентификации генов, влияющих на структуру шипиков.
- Оценить кальциевые транзиенты в дендритных шипиках во время нейронной активности.
Используемые методы
- Методы прижизненной визуализации с использованием лазерного сканирующего конфокального микроскопа.
- Биологическая модель представлена ГАМК-ергическими нейронами C. elegans.
- Методы включают иммобилизацию червей для получения изображений высокого разрешения.
- Визуализация кальция проводится с использованием GCaMP и методов оптогенетической активации.
- Анализ данных включает количественную оценку плотности шипиков и изменений интенсивности флуоресценции.
Основные результаты
- Дендритные шипики у взрослых особей C. elegans преимущественно имеют тонкую грибовидную морфологию.
- После оптогенетической активации в шипиках обнаруживаются переходные кальциевые сигналы, что указывает на ответы на нейронную активность.
- Измерение плотности шипиков показало в среднем 3,4 шипика на 10 мкм дендрита DD.
Выводы
- В ходе исследования успешно разработаны протоколы прижизненной визуализации для анализа дендритных шипиков.
- Данные, полученные в исследовании, способствуют пониманию морфологии и функций шипиков у C. elegans.
- Эти методы могут помочь в дальнейшем изучении нейронных механизмов, связанных с пластичностью и дисфункцией.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный протокол позволяет визуализировать структуру и функцию дендритных шипиков in vivo в генетически модифицируемой модели, что способствует валидации мишеней в синаптической биологии. Связывая пресинаптическую холинергическую активацию с постсинаптическими кальциевыми транзиентами в ГАМК-ергических нейронах, этот метод обеспечивает количественный и воспроизводимый анализ для изучения механизмов синаптической пластичности. Такой подход облегчает механистическую оценку рисков генетических хитов, влияющих на морфогенез шипиков, что представляет прогностическую ценность для разработки нейротерапевтических препаратов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать генетические детерминанты плотности и морфологии дендритных шипиков в определенной нейронной цепи.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизированный, количественный анализ структуры шипиков (количество шипиков на 10 µm) и функционального ответа (Delta F/F) для исследований взаимодействия с мишенью.
- Прогностическая ценность: позволяет проводить фенотипический скрининг соединений или генетических модификаторов, изменяющих морфологию шипиков или активность кальциевой сигнализации.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: позволяет получать высококонтентные морфологические и функциональные данные от живых животных, обеспечивая корреляцию формы шипика (тонкий/грибовидный по сравнению с филоподиальным/короткий) с нейронной активностью.
- Операционная ценность: устанавливает воспроизводимый рабочий процесс визуализации с использованием микроскопии сверхвысокого разрешения и конфокальной микроскопии с вращающимся диском при определенном лазерном возбуждении (488 nm для GCaMP, 561 nm для Chrimson) и 3D-деконволюцией.
- Готовность метода: результаты включают классификацию шипиков, показатели плотности и трейсы вызванных кальциевых транзиентов, пригодные для валидации хитов в нейрофармакологическом скрининге.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная значимость: Использование системы, релевантной для патологий, в которой морфогенез дендритных шипиков модулируется нейронной активностью, что отражает механизмы синаптической пластичности в моделях млекопитающих.
- Снижение механистических рисков: Позволяет разделять пресинаптический и постсинаптический вклады в передачу кальциевых сигналов с помощью оптогенетической стимуляции и генетически кодируемых сенсоров.
- Доклиническая преемственность: Обеспечивает возможность лонгитюдной оценки динамики шипичков у живых животных, что упрощает корреляцию с поведенческими или фармакологическими вмешательствами.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод применим на этапах от раннего поиска до доклинических исследований, что позволяет проводить итеративное тестирование генетических или фармакологических модификаторов структуры и функции синапсов.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез о генах, регулирующих формирование и стабильность богатых актином шипиков, с помощью количественного морфологического анализа.
- Скрининг: предоставляет стандартизированные, готовые к анализу данные (плотность шипиков, Delta F/F) для оценки влияния соединений на целостность синапсов.
- Аналитика: генерирует нормализованные показатели кальциевых транзиентов (Delta F/F относительно F0) и данные по классификации шипиков для сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: связывает структуру синапса с его функцией в определенной моторной цепи, обеспечивая получение показателей, согласованных с биомаркерами модуляции сигнальных путей.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу визуализации для исследований хронической или острой модуляции на различных генетических фонах и при разных условиях лечения.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность путем прямой связи пресинаптической оптогенетической стимуляции с постсинаптическими кальциевыми ответами в дендритных шипиках.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость за счет стандартизированной иммобилизации, конфигурации лазера и алгоритмов анализа изображений (критерий Шапиро-Уилка, ANOVA с апостериорной коррекцией).
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go), предоставляя ранние количественные доказательства воздействия на пути синаптической пластичности.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию генетических мишеней или соединений с учетом рисков на основе их воздействия на плотность шипиков и функциональную кальциевую сигнализацию.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с живыми животными, создания трансгенных конструкций (GCaMP, Chrimson) и использования конфокальной микроскопии с возможностью сверхразрешения.
- Метод зависит от наличия лазерных сканирующих или дисковых конфокальных систем с точным контролем длины волны (488 nm, 561 nm) и системой контроля условий окружающей среды для длительной визуализации.
- Необходима межгрупповая стандартизация подготовки червей, протоколов кормления ATR и пороговых значений анализа изображений (score >7, вычитание фона).
- Адаптация метода для других типов нейронов требует подтверждения специфичности промотора и возможности обнаружения шипиков в альтернативных GABAergic или non-GABAergic классах.
- Практические ограничения включают чувствительность к движению червей во время регистрации данных и зависимость активации Chrimson от ATR, которая должна контролироваться экспериментально.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:53
Determination of Dorsal D (DD) Dendritic Spines Structure
2:44
Assessing Activation of DD Dendritic Spines by Presynaptic Cholinergic Signaling
7:06
Results: Imaging and Assessing the Function of DD Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans
8:37
Conclusion
