Пространственно-временная визуализация in vivo систем доставки глазных лекарств с использованием волоконно-оптической конфокальной лазерной микроскопии

Этот протокол облегчает скрининг новых составов, чтобы лучше понять, как модификации влияют на время их пребывания в тканях, что имеет решающее значение для разработки оптимальной системы доставки лекарств. Этот метод является неинвазивным и позволяет получать изображения в режиме реального времени, что уменьшает чрезмерное использование животных для отбора проб. Системы доставки лекарств могут быть переработаны для визуализации и терапевтических применений путем простого включения терапевтического препарата и фрагмента визуализации в один наноноситель.

Это имеет полезные применения как в лечении рака, так и в инфекционных заболеваниях. Продемонстрировать процедуру будет Раша Мсаллам, старший научный сотрудник моей лаборатории. Для начала, за два часа до субконъюнктивальной инъекции, введите мыши внутривенно через хвост с 2,5 миллиграммами на килограмм эвансовского синего, или ЭБ. После седации мыши 5% изофлураном перенесите мышь на носовой конус и выдержите седативную мышь на грелке.

Затем обрежьте усы возле глаза, чтобы сделать инъекцию. Закапывают каплей 0,5% раствора проксиметакаина гидрохлорида непосредственно на глаз. Затем загрузите 10-микролитровый стеклянный шприц, оснащенный иглой 32-го калибра с флуоресцентными липосомами, и убедитесь, что пузырьки воздуха не присутствуют в шприце.

Используя пинцет, поднимите конъюнктиву и медленно вводите липосомы в субконъюнктивальное пространство, затем медленно вынимайте иглу, предотвращая обратный поток. Обеспечивают образование блеба, заполненного флуоресцентными липосомами. Введите каплю 1% фузистой кислоты на глаз и следите за мышью, пока она не придет в сознание.

Включите систему CLM. Подключите зонд к системе CLM. Выберите поле зрения и расположение для файлов сбора на этом этапе.

Отрегулируйте интенсивность лазера, чтобы гарантировать, что обнаружение флуоресценции для флуоресцеина DHPE находится в линейном диапазоне, и сохраняйте интенсивность последовательной для сравнения между изображениями, сделанными в разные моменты времени. После того, как система прогреется в течение 15 минут, откалибруйте систему в соответствии с инструкциями производителя с помощью калибровочного комплекта, содержащего растворы для очистки, ополаскивания и фтор-4 для каждого лазера. Вкратце, начните калибровку, погружая наконечник на пять секунд каждый в очищающий флакон, а затем во флакон для полоскания.

Оставьте наконечник в воздухе для фоновой записи, чтобы нормализовать фоновые значения от зондов различными волокнами, обеспечивая однородность изображения. Снова погрузите наконечник на пять секунд в очищающий флакон, а затем во флакон для полоскания. Далее погружают наконечник во флакон, содержащий фтор-4 488-нанометр, на пять секунд для нормализации значений сигнала.

Повторите погружение наконечника на пять секунд в очищающий флакон с последующим промывочным флаконом. Держите наконечник во флаконе для промывки до тех пор, пока сигнал флуоресценции, записанный на предыдущем этапе, не исчезнет. Затем перенесите наконечник во флакон, содержащий фтор-4 660-нанометр для нормализации значений сигнала от разных волокон в зонде.

После калибровки убедитесь, что значение фона зонда меньше 100. В противном случае выполните повторную очистку зонда с помощью аппликатора хлопкового наконечника. Включите регулятор температуры животных с прикрепленной грелкой и отрегулируйте температуру до 37 градусов по Цельсию.

После покрытия грелки хирургической драпировкой закрепите носовой конус на грелке. После седации мыши с использованием 5% изофлурана в индукционной камере перенесите мышь к носовому конусу и выдерживайте седативную мышь на грелке. Затем закапывают в глаз каплю анестетика 0,5% раствора проксиметакаина гидрохлорида.

Чтобы промыть глазную поверхность и избежать кристаллизации хрусталика, держите глаза смазанными, опуская несколько солевых капель. Затем поверните и отрегулируйте окуляр микроскопа, чтобы эргономично рассмотреть глаз мыши в прямом фокусе с увеличением в 0,67 раза. Включите лазер и поместите зонд, как ручку, непосредственно на область глаз для получения изображения.

Затем начните записывать приобретение, чтобы наблюдать флуоресценцию в глазу в интересующей области. Остановите запись, когда все области будут помечены и помечены в соответствии с картой глаз, чтобы узнать точное местоположение зонда в точном кадре. Файлы получения будут автоматически сохранены как видеофайлы в ранее выбранном расположении.

Флуоресцентная визуализация выявила четкую дифференциацию между областями склеры и роговицы. Высокая васкуляризация эписклер и конъюнктивы привела к тому, что область склеры окрашивалась в красный цвет с EB. Роговица, которой не хватает сосудистой системы, оказалась черной. Контрастная флуоресценция лимбуса и склеры наблюдалась в семидневном исследовании.

Контрольные мыши, которым вводили флуоресцеиновый краситель, подтвердили специфичность флуоресценции, полученной из липосом. Интенсивность флуоресценции была высокой в первый и третий дни. Зеленая флуоресценция со временем способствовала уменьшению липосом в областях лимбуса и склеры.

Различия в флуоресцентных сигналах с первого по третий день после инъекции в областях височного лимбуса и верхнего лимбуса не были значительными, что указывает на предпочтение нейтральных липосом области лимбуса, особенно периферии роговицы. Для височной и верхней областей в первый день после инъекции флуоресценция в склерах была в шесть раз выше, чем в лимбе. К третьему и седьмому дню липосомы были значительно снижены в склере в височной и верхней областях, что объясняется механизмами глазного клиренса.

Наименьшее количество флуоресценции было обнаружено в носовой и нижней областях, из-за расстояния от места инъекции. Важно пометить рамки пятен в соответствии с картой глаз до остановки записи. Поддерживайте постоянную интенсивность лазера и определите максимальное фоновое значение для правильного сравнения в различных экспериментах.

После идентификации свинцовых составов могут быть проведены комплексные фармакокинетические и биораспределения на животных для изучения биодоступности препарата и подтверждения терапевтической эффективности их составов.