Гиперактивный piggyBac Транспозазно-опосредованная трансформация зародышевой линии у травяной совки, Spodoptera frugiperda
23 сентября 2021 г.
Успешная трансформация зародышевой линии у травяной совки, Spodoptera frugiperda,была достигнута с помощью мРНК гиперактивной транспоза piggyBac.
Этот протокол показывает производство трансгенной травяной совки с использованием системы трансформации на основе piggyBac. Мы надеемся, что эти методы принесут пользу улучшению трансформации не только у травяной совки, но и у чешуекрылых насекомых. Метод, описанный здесь, делает трансформацию зародышевой линии чешуекрылых насекомых-вредителей эффективной.
Продемонстрировать процедуру будет доктор Сиен Чен, постдокторант в моей лаборатории. Начните с помещения 12 мужских куколок и 12 женских куколок в коробку. Поместите 10%-ный раствор сахарозы в коробку для кормления взрослых.
Накройте коробку бумажным полотенцем. На второй день после эклозии подвергайте взрослых интенсивному свету в течение ночи. На третий день после эклозии переведите взрослых особей в темное место.
Соберите эмбрионы в течение двух часов после чрезмерного положения. Добавьте капли воды на лист бумажного полотенца со свежими яйцами, хранящимися в чашке Петри на льду. Аккуратно переложите яйца на стеклянную горку тонкой кистью и выровняйте их по одному на стеклянной горке.
Держите стеклянные горки с яйцами выровненными по льду перед микроинъекцией. Вводят смесь 200 нанограммов на микролитр EGFP на основе piggyBac, экспрессирующую плазмиду, 200 нанограммов на микролитр гиперактивной мРНК транспозазы piggyBac и стерильную дистиллированную воду в яйца, используя компенсационное давление автоматизированного микроинжектора. Держите введенные яйца при температуре 27 плюс-минус один градус Цельсия, 60 плюс-минус 10% относительной влажности до вылупления.
Кормите вылупившихся личинок на искусственной диете и переведите каждую личинку в одну маленькую чашку на ранней стадии творога и звезды. Соберите куколок и поместите в клетку около 150 самок и 150 самцов. Повесьте несколько кусочков бумажных полотенец размером 30 сантиметров на 15 сантиметров в клетку, чтобы собрать яйца.
Ежедневно собирайте бумажные полотенца с яйцами и храните яйца в соответствующих условиях до вылупления. Держите новорожденных личинок при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут, чтобы обездвижить их, а затем перенесите их на ледяную пластину. Скрининг обездвиженных личинок новорожденных под флуоресцентным стереомикроскопом.
Выберите EGFP-положительных новорожденных, поднимите их до стадии куколки, примерно через две недели при температуре 27 плюс-минус один градус Цельсия. Гиперактивная мРНК-транспозазы piggyBac, синтезированная in vitro, была обнаружена с использованием 1% агарозного геля. Эмбрионы, введенные PDS, не показали сигнала EGFP, в то время как EGFP-экспрессирующие плазмиды и гиперактивные транспозазы piggyBac транспозазы, введенные мРНК, показали флуоресценцию EGP, что указывает на то, что конструкция piggyBac была успешной.
Личинки G1, полученные из яиц в результате самокрещивания взрослых особей G0, показали сильный сигнал EGFP. Фрагмент, содержащий промотор и фрагмент EGFP, был успешно амплифицирован с использованием геномной ДНК, выделенной из EGFP-положительных личинок в качестве шаблона. Однако тот же фрагмент не был обнаружен, когда геномная ДНК была выделена из личинок дикого типа в качестве шаблона.
Яйца для микроинъекции должны быть как можно более свежими и всегда должны храниться на льду перед микроинъекцией, чтобы замедлить их развитие. Этот метод прокладывает путь для исследователей, чтобы ответить на вопросы в функциональной геномике насекомых-вредителей и разработать методы генетического контроля для этого глобального вредителя.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен протокол успешной трансформации зародышевой линии кукурузного мотылька, Spodoptera frugiperda, с использованием системы трансформации на основе piggyBac. Данный метод обеспечивает повышение эффективности трансформации у вредителей из отряда чешуекрылых и расширяет возможности функциональных геномных исследований этих организмов.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Генная инженерия насекомых-вредителей
- Методы трансформационной биологии
- Применение функциональной геномики
Теоретические сведения
- Кукурузная листовая совка является значимым сельскохозяйственным вредителем.
- Система транспозонов piggyBac известна своей эффективностью в доставке генов.
- Совершенствование трансформации зародышевой линии имеет решающее значение для стратегий борьбы с вредителями.
Используемые методы
- Микроинъекция яиц плазмидой piggyBac и мРНК
- Spodoptera frugiperda в качестве биологической модели
- Флуоресцентная микроскопия для скрининга трансгенных личинок
Основные результаты
- Успешная экспрессия EGFP в трансгенных личинках подтвердила функциональность системы piggyBac.
- Экспрессия EGFP была подтверждена путем амплификации геномной ДНК, что позволило отличить трансгенных личинок от личинок дикого типа.
- Метод трансформации оказался эффективным для создания генетически модифицированных насекомых-вредителей.
Выводы
- В исследовании разработан надежный метод герминальной трансформации Spodoptera frugiperda.
- Полученные результаты способствуют развитию мер генетического контроля сельскохозяйственных вредителей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Создание эффективной системы трансформации зародышевой линии у сельскохозяйственных вредителей, таких как кукурузная листовая совка, позволяет использовать методы функциональной геномики для валидации мишеней и снижения механистических рисков в процессах разработки средств борьбы с вредителями. Данный протокол способствует проведению ранних исследований, предоставляя масштабируемую систему для изучения функций генов и оценки фенотипических результатов на релевантной модели насекомого. Успешный трансгенез облегчает последующий скрининг и поиск биомаркеров для разработки стратегий генетического контроля численности вредителей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Обеспечивает возможность функционального анализа генов вредителей для проверки мишеней в стратегиях генетического контроля.
- Операционная ценность: Предоставляет воспроизводимую систему создания трансгенных линий для последовательной оценки мишеней.
- Прогностическая ценность: Способствует механистическому снижению рисков путем установления связи между нарушением функции гена и фенотипическими эффектами на модели вредителя.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: создание линий с флуоресцентными репортерами для высокопроизводительного скрининга генетических пертурбаций.
- Практическая ценность: возможность проведения стандартизированного генотипирования на основе ПЦР и TAIL-ПЦР для валидации сайта вставки.
- Готовность к анализу: получение стабильных трансгенных штаммов, подходящих для скрининга соединений и фенотипического анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: Связывает валидацию генов на этапе открытия с доклинической оценкой механизмов генетического контроля.
- Продвижение с учетом рисков: Облегчает оценку жизненно важной роли гена и фенотипического воздействия перед применением в полевых условиях.
- Согласование биомаркеров: Поддерживает идентификацию генетических маркеров, связанных с признаками восприимчивости или устойчивости.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска путем обеспечения валидации мишени посредством трансгенеза, поддержки идентификации ведущих соединений с помощью фенотипического скрининга и обоснования доклинических решений на основе стабильных генетических моделей.
- Открытия в биологии: Обеспечивает проверку гипотез путем нокаута или гиперэкспрессии генов у кукурузного мотылька для оценки значимости мишени.
- Скрининг: Позволяет создавать стандартизированные трансгенные линии для воспроизводимого скрининга генетических или химических модуляторов.
- Аналитика: Предоставляет данные количественной ПЦР и флуоресцентного анализа для измерения уровней интеграции и экспрессии трансгена.
- Трансляционные исследования: Связывает открытие функций генов с доклинической оценкой генетических подходов к борьбе с вредителями.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу трансгенеза, применимую к различным видам вредителей из отряда чешуекрылых для валидации мишеней в рамках всего портфеля разработок.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает достоверность валидации мишени посредством прямого генетического манипулирования на модели вредителя.
- Операционная ценность: предоставляет масштабируемую, воспроизводимую систему трансгенеза со стандартизированными протоколами микроинъекций и скрининга.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет снижения биологической неопределенности в вопросе жизненной важности мишени.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию мишеней с учетом рисков на основе фенотипической валидации in vivo на модели вредителя.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области эмбриологии насекомых и методах микроинъекций.
- Необходимы автоматический микроинжектор, флуоресцентный стереомикроскоп и оборудование для ПЦР для проведения валидации.
- Требуются стандартизированные протоколы сбора эмбрионов, условий инъекций и скрининга трансгенных линий для всех рабочих групп.
- Необходима адаптация протоколов температуры, влажности и питания для различных видов чешуекрылых (Lepidoptera).
- Результат зависит от качества и свежести эмбрионов; эффективность микроинъекций зависит от стадии развития.
