Извлечение кофактора F420 для анализа длины хвоста полиглутамита из метаногенных чистых культур и образцов окружающей среды
14 октября 2021 г.
Метод извлечения кофактора F420 из чистых культур оптимизирован для жидкостного хроматографического разделения и анализа длины хвоста F420 в чистых культурах и образцах окружающей среды.
Кофактор F420 играет важную роль в первичном и вторичном метаболизме многих прокариот. Измерение этой молекулы в образцах окружающей среды позволяет глубже понять ее распространенность и функцию. Этот метод позволяет анализировать кофактор в сложных пробных материалах, таких как шлам и почва.
Таким образом, лизис материала и предварительная очистка перед анализом являются центральными этапами. Протокол включает в себя различные этапы во время подготовки образца. Эти шаги должны быть спланированы и подготовлены очень хорошо, прежде чем начинать обработку образца.
Например, важна подготовка свежих буферов. Чтобы начать лизис образца, поместите пять граммов образца в 50-миллилитровую коническую пробирку. Затем добавьте пять миллилитров буфера лизиса 2X к образцам и доведите объем до 10 миллилитров дистиллированной водой, чтобы достичь конечной концентрации 0,5 грамма на миллилитр.
Вихрь разбавленных образцов в течение 20 секунд с последующим автоклавированием в течение 30 минут при 121 градусе Цельсия. Для сухих образцов, таких как лесная почва, доведите до конечного объема 20 миллилитров дистиллированной водой после автоклавирования и снова вращайте разбавленный образец в течение 20 секунд, как показано. Как только образцы остынут, центрифугируйте образец лизата в течение пяти минут при 11 000 х г и соберите супернатант.
Готовят пятимиллилитровую твердофазную экстракцию или колонну SPE, заполненную 100 миллиграммами слабого аниона смешанного режима полимерного сорбента, обусловливающего анионообменник тремя миллилитрами метанола. Затем уравновешивайте анионообменник тремя миллилитрами дистиллированной воды. Загрузите до девяти миллилитров супернатанта из центрифугированного лизата на колонну SPE.
Последовательно смывают примеси из колонки пятью миллилитрами 25-миллимолярного ацетата аммиака и пятью миллилитрами метанола. После промывки элюируют кофактор F420 одним миллилитром буфера элюирования. Предустановите духовку на 40 градусов цельсия и установите флуоресцентный детектор на длину волны вымирания 420 нанометров и длину волны излучения 470 нанометров.
Затем отфильтруйте элюированный образец из SPE во флаконы ВЭЖХ с помощью фильтра PTFE с размером пор 0,22 мкм. Вводят 50 микролитров отфильтрованного образца в систему ВЭЖХ и отделяют кофактор F420 через режим градиента, используя комбинацию подвижных фаз, как описано в рукописи. Анализ состава и концентрации кофактора F420.
Рост чистых культур метаногенов был подтвержден с помощью микроскопии. В фазово-контрастной микроскопии видны агломераты метаногенов, которые излучают голубоватый свет при возбуждении кофактора F420 ультрафиолетовым светом. Проанализирована пиковая площадь восстановленного кофактора F420 после SPE с различными объемами культур Methanoculleus thermophilus.
Стратегия автоклавной дезинтеграции достигла самой высокой пиковой площади, заключив максимальную эффективность экстракции с использованием обработки давлением и температурой. Анализ распределения длины хвоста выявил различия в общей концентрации кофактора F420 и распределении F420 хвостовой длины чистых метаногенных культур в образцах окружающей среды. При применении этой процедуры следует помнить о том, чтобы полностью собрать общий объем буфера элюирования или записать точный объем потока.
Этот метод прокладывает путь для исследования кофактора F420 в более сложных образцах, таких как почвы и шламы, и позволяет глубже понять экологическое воздействие этой молекулы.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен оптимизированный метод экстракции и анализа кофактора F420 из чистых культур и проб окружающей среды. Основное внимание в данной методике уделяется жидкостному хроматографическому разделению по длине «хвоста» F420, что имеет решающее значение для понимания его роли в метаболизме прокариот.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биохимия
- Экология
Теоретическая часть
- Кофактор F420 играет важную роль в метаболизме прокариот.
- Измерение содержания F420 в образцах из окружающей среды помогает понять степень его распространенности.
- Анализ может быть затруднен из-за сложности состава образцов.
- Эффективная пробоподготовка необходима для получения точных результатов.
Цель исследования
- Оптимизировать метод экстракции кофактора F420.
- Улучшить анализ F420 в сложных матрицах образцов.
- Предоставить подробный протокол для исследователей.
Используемые методы
- Методы жидкостного хроматографического разделения.
- Этапы лизиса и предварительной очистки образцов.
- Тщательное планирование подготовки образцов.
- Анализ длины хвоста F420.
Основные результаты
- Оптимизированный метод экстракции улучшает анализ F420.
- Успешное применение к сложным экологическим образцам.
- Подробный протокол способствует воспроизводимости.
- Данные о роли F420 в метаболизме.
Выводы
- Данный метод расширяет понимание кофактора F420.
- Он представляет собой надежный подход для будущих исследований.
- Потенциальные области применения в экологическом мониторинге.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Анализ профилей длины хвоста кофактора F420 позволяет дифференцировать метаногенные пути в сложных средах, что способствует валидации мишеней при разработке анаэробных биопроцессов. Данный метод обеспечивает механистическое снижение рисков, связывая экспрессию F420 с метаболической активностью в чистых культурах и природных образцах, что дает информацию для отбора штаммов и оптимизации процессов. Этот подход обеспечивает прогностическую достоверность при скрининге микробных сообществ в биореакторах и почвенных системах без использования генетических инструментов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, связывая распределение длины хвоста F420 со специфическими метаногенными фенотипами в чистых культурах.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет прямого измерения экспрессии кофактора в качестве функционального показателя активности метаболического пути.
- Прогностическая ценность: облегчает приоритизацию портфеля путем разграничения гидрогенотрофных и ацетокластических метаногенов на основе профилей F420.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующих этапов анализа путем получения количественных данных о длине хвоста F420 из матриц окружающей среды.
- Операционная ценность: Обеспечение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет использования твердофазной экстракции и разделения методом ВЭЖХ независимо от культивирования.
- Масштабируемость: Готовность к скринингу и возможность повторного использования платформы для анализа экспрессии кофакторов в иле, почве и анаэробных реакторах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: Обсуждается значимость для изучения заболеваний путем установления связи между анализом F420 и функционированием микробных сообществ в анаэробных средах, имеющих отношение к ассоциированным с хозяином микробиомам.
- Прогресс с учетом рисков: Описывается последовательный переход от этапа открытия к доклинической валидации за счет обеспечения возможности лонгитюдного отслеживания экспрессии F420 в образцах биопроцессов.
- Механистическое снижение рисков: Основное внимание уделяется прогностической ценности снижения рисков за счет использования профилей длины хвоста F420 в качестве биомаркеров активации метаболических путей.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Метод занимает определенное место в континууме исследований — от раннего поиска до идентификации ведущих соединений и доклинической работы, обеспечивая проверку гипотез и уточнение метаболических путей в анаэробных системах.
- Биология открытий: Объясняет, как данный метод поддерживает проверку гипотез, связывая восстановление F420 со специфическим ростом и активностью метаногенов.
- Скрининг: Описывает готовность анализа к применению благодаря воспроизводимой экстракции и детектированию F420 методом ВЭЖХ в различных типах образцов.
- Аналитика: Акцентирует внимание на количественном измерении концентрации F420 и распределения длины хвоста, что позволяет сравнивать метаболические состояния.
- Трансляционные исследования: Связывает метод с преклинической преемственностью, обеспечивая возможность мониторинга экспрессии кофактора в биореакторах и симуляциях почв.
- Корпоративное повторное использование: Представляет метод как многократно используемый инструмент для рутинного профилирования анаэробных микробных сообществ в промышленных и экологических условиях.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение достоверности прогнозирования при валидации мишени за счет прямой корреляции профилей F420 с использованием метаногенных путей.
- Операционная ценность: Стандартизация и воспроизводимость благодаря рабочему процессу SPE-HPLC, не зависящему от генетических или культуральных методов.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет возможности быстрого фенотипического скрининга метаногенной активности в сложных образцах.
- Влияние на портфель: Приоритизация с учетом рисков на основе уровней экспрессии F420 и паттернов длины хвоста, указывающих на метаболическую пригодность.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с анаэробными образцами и методами флуоресцентного детектирования.
- Необходима система ВЭЖХ с флуоресцентным детектором при возбуждении 420 nm и эмиссии 470 nm.
- Требуется межгрупповая стандартизация процедур лизиса, ТФЭ и объемов элюирования для обеспечения воспроизводимого извлечения F420.
- При подготовке проб необходимо учитывать особенности адаптации метода в зависимости от содержания твердых частиц в почвах по сравнению с илами.
- Существуют практические ограничения, такие как возможная деградация кофактора, если объем элюата собран или зафиксирован не полностью.
