Извлечение кофактора _F420 для анализа длины хвоста полиглутамита из метаногенных чистых культур и образцов окружающей среды

Метод извлечения кофактора _F420 из чистых культур оптимизирован для жидкостного хроматографического разделения и анализа длины хвоста _F420 в чистых культурах и образцах окружающей среды.

Кофактор F420 играет важную роль в первичном и вторичном метаболизме многих прокариот. Измерение этой молекулы в образцах окружающей среды позволяет глубже понять ее распространенность и функцию. Этот метод позволяет анализировать кофактор в сложных пробных материалах, таких как шлам и почва.

Таким образом, лизис материала и предварительная очистка перед анализом являются центральными этапами. Протокол включает в себя различные этапы во время подготовки образца. Эти шаги должны быть спланированы и подготовлены очень хорошо, прежде чем начинать обработку образца.

Например, важна подготовка свежих буферов. Чтобы начать лизис образца, поместите пять граммов образца в 50-миллилитровую коническую пробирку. Затем добавьте пять миллилитров буфера лизиса 2X к образцам и доведите объем до 10 миллилитров дистиллированной водой, чтобы достичь конечной концентрации 0,5 грамма на миллилитр.

Вихрь разбавленных образцов в течение 20 секунд с последующим автоклавированием в течение 30 минут при 121 градусе Цельсия. Для сухих образцов, таких как лесная почва, доведите до конечного объема 20 миллилитров дистиллированной водой после автоклавирования и снова вращайте разбавленный образец в течение 20 секунд, как показано. Как только образцы остынут, центрифугируйте образец лизата в течение пяти минут при 11 000 х г и соберите супернатант.

Готовят пятимиллилитровую твердофазную экстракцию или колонну SPE, заполненную 100 миллиграммами слабого аниона смешанного режима полимерного сорбента, обусловливающего анионообменник тремя миллилитрами метанола. Затем уравновешивайте анионообменник тремя миллилитрами дистиллированной воды. Загрузите до девяти миллилитров супернатанта из центрифугированного лизата на колонну SPE.

Последовательно смывают примеси из колонки пятью миллилитрами 25-миллимолярного ацетата аммиака и пятью миллилитрами метанола. После промывки элюируют кофактор F420 одним миллилитром буфера элюирования. Предустановите духовку на 40 градусов цельсия и установите флуоресцентный детектор на длину волны вымирания 420 нанометров и длину волны излучения 470 нанометров.

Затем отфильтруйте элюированный образец из SPE во флаконы ВЭЖХ с помощью фильтра PTFE с размером пор 0,22 мкм. Вводят 50 микролитров отфильтрованного образца в систему ВЭЖХ и отделяют кофактор F420 через режим градиента, используя комбинацию подвижных фаз, как описано в рукописи. Анализ состава и концентрации кофактора F420.

Рост чистых культур метаногенов был подтвержден с помощью микроскопии. В фазово-контрастной микроскопии видны агломераты метаногенов, которые излучают голубоватый свет при возбуждении кофактора F420 ультрафиолетовым светом. Проанализирована пиковая площадь восстановленного кофактора F420 после SPE с различными объемами культур Methanoculleus thermophilus.

Стратегия автоклавной дезинтеграции достигла самой высокой пиковой площади, заключив максимальную эффективность экстракции с использованием обработки давлением и температурой. Анализ распределения длины хвоста выявил различия в общей концентрации кофактора F420 и распределении F420 хвостовой длины чистых метаногенных культур в образцах окружающей среды. При применении этой процедуры следует помнить о том, чтобы полностью собрать общий объем буфера элюирования или записать точный объем потока.

Этот метод прокладывает путь для исследования кофактора F420 в более сложных образцах, таких как почвы и шламы, и позволяет глубже понять экологическое воздействие этой молекулы.