Анализ мокроты с контролем качества с помощью проточной цитометрии
9 августа 2021 г.
Этот протокол описывает эффективный метод диссоциации мокроты на одноклеточную суспензию и последующую характеристику клеточных подмножеств на стандартных проточных цитометрических платформах.
Этот протокол решает общие проблемы, возникающие при обработке мокроты, которые в прошлом затрудняли использование с проточной цитометрией для высокопроизводительных клинических диагностических целей. Этот протокол предназначен для экономии времени за счет использования веса мокроты для определения объемов окрашивания антител и красителей. Во время окрашивания инкубации может быть выполнен подсчет клеток для последующих этапов.
Важно достичь точного количества клеток, чтобы определить правильный объем повторной суспензии, чтобы предотвратить любые проблемы при работе на проточном цитометре. Этот протокол может дать представление о областях исследований, которые исследуют здоровье легких. Например, могут быть изучены такие заболевания, как ХОБЛ, астма, рак легких или последствия COVID.
Демонстрировать процедуру будет доктор Майкл Лай, ученый-исследователь из моей лаборатории. Для начала взвесьте образец мокроты, чтобы определить объемы диссоциационных реагентов. Перенесите образец в сосуд соответствующего размера в зависимости от веса мокроты, затем добавьте один миллилитр на грамм 0,5% NAC и четыре миллилитра на грамм 0,1% DTT.
Вращайте образцы на максимальной скорости в течение 15 секунд и породу на максимальной скорости в течение 15 минут при комнатной температуре. Разбавьте этот образец 4X сбалансированным солевым раствором Хэнкса или HBSS для нейтрализации NAC и DTT. А после быстрого вихря качайте образец при комнатной температуре в течение пяти минут.
Фильтрационная клеточная суспензия через 100-микрометровый нейлоновый сетчатый сетчатый фильтр в одну или несколько конических центрифужных трубок по 50 миллилитрам для создания одноэлектрической суспензии. Гранулируйте ячейки. После аспирации супернатанта смешайте гранулы в одной конической трубке объемом 15 миллилитров и промывайте HBSS в тех же условиях.
Повторно суспендируют ячейку гранулы в объеме буфера, определяемом начальным весом образца мокроты. Возьмите аликвоту из клеточной суспензии и смешайте 10 микролитров разведения мокроты с 30 микролитрами 0,4% трипанового синего цвета, затем загрузите в счетные камеры гемоцитометра для подсчета живых/мертвых клеток. Этикетирование мокроты в компенсационных трубках.
Добавьте антитела HBSS и краситель в каждую трубку клетки мокроты и компенсационные трубки, как указано в тексте. Добавьте ячейки мокроты в пробирки и добавьте компенсационные шарики к компенсационным трубкам, как указано в тексте. Высиживать все тюбики на льду, защищенном от света, в течение 35 минут.
Затем, заполнив трубки ледяным холодом HBSS, центрифугируют при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут в 800 раз больше G. Для компенсационных трубок аспирируйте супернатант как можно ближе к гранулам и щелкните гранулами, чтобы ослабить. Затем добавьте 0,5 миллилитра холодного HBSS в компенсационные трубки и храните трубки на льду в легкой защищенной зоне до тех пор, пока не понадобится анализ проточной цитометрии. Затем аспирируют супернатант из неокрашенной мокроты, изотипа, крови и эпителиальных трубок.
Ослабьте гранулы, щелкнув трубками. Добавьте два миллилитра 1% PFA к неокрашенным и изотипным пробиркам и 10 миллилитрам в кровь и эпителиальные трубки. Инкубируйте трубки на льду в светозащитной манере в течение 30 минут, затем быстро вихрьте на максимальной скорости и снова высиживайте еще 30 минут.
Затем наполните трубки ледяным холодом HBSS. Далее центрифугируют трубки при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут в 1,600 раз больше G.Аспират как можно больше супернатанта, не нарушая гранулу клетки, и щелкают трубкой пальцами, чтобы ослабить клетки, затем добавляют 200 микролитров холодного HBSS в неокрашенные и изотипные трубки. Рассчитайте и сложите необходимый объем HBSS для повторного суспензии крови и эпителиальной трубки в соответствии с общим количеством клеток.
Храните все образцы в компенсационных трубках, защищенных от света на льду при четырех градусах Цельсия, до тех пор, пока не будет выполнен анализ проточной цитометрии. Примените соответствующие процедуры запуска для используемого проточного цитометра. Используйте смесь бусин Национального института стандартов и технологий или NIST, чтобы гарантировать, что напряжения прямого рассеяния и бокового рассеяния установлены для размещения бусин NIST для охвата участка, не помещая бусины слишком близко к осям.
Установите скорость потока на среднюю для LSRII или высокую для Navios EX. Отрегулируйте напряжение для каждого параметра, используемого для параметров рассеяния и флуоресцентных параметров, чтобы поместить популяции клеток в масштабе. Используйте цифры со стратегией гатинга в качестве руководства для соответствующей регулировки напряжения. Сначала соберите данные для неокрашенного образца мокроты, затем образца, окрашенного изотипом, а затем пробирки крови и эпителиальной трубки.
Масса мокроты использовалась для определения объемов антител или красителей для окрашивания. Корреляция между массой мокроты и выходом клеток не была сильной. Образцы мокроты были разделены на четыре весовые категории, которые группировались в распределении выхода клеток.
Каждое использованное антитело титровали в концентрации на фазе плато с самым высоким индексом окрашивания, выбранным в качестве рабочей концентрации. Во всех весовых категориях среднее загрязнение SEC составляло менее 20% при процентном соотношении жизнеспособных клеток. Представлена стратегия гатинга, используемая для анализа.
Бусины NIST использовались для установки ворот, которые были применены к образцу мокроты для устранения мусора. Мелкий мусор был дополнительно устранен шириной ворот. Краситель жизнеспособности использовался для устранения мертвых клеток, в то время как синглетные ворота удаляли дублеты.
Маркировка антител против CD45 позволила разделить живые одиночные клетки мокроты на клетку крови и некремянный клеточный компартмент. Сравнивались профили, полученные от Navios EX, LSRII и Lyric. Показана стратегия уничтожения мусора, мертвых клеток, дублетов и сравнения профилей крови и не крови.
Эта методика позволила применить эти методы для выявления риска рака легких для использования в качестве неинвазивного клинического теста.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Данный протокол решает распространенные проблемы, возникающие при обработке мокроты, что облегчает ее использование в проточной цитометрии для высокопроизводительной клинической диагностики. В нем подчеркивается важность точного подсчета клеток и объема ресуспендирования для успешного проведения анализа методом проточной цитометрии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Проточная цитометрия
- Клеточная биология
- Исследования здоровья легких
Теоретическая часть
- Обработка мокроты исторически создавала сложности для проточной цитометрии.
- Точный подсчет клеток имеет решающее значение для эффективного анализа.
- Области исследований включают ХОБЛ, астму, рак легких и COVID-19.
- Данный протокол направлен на оптимизацию анализа мокроты для клинической диагностики.
Цель исследования
- Обеспечение эффективного метода диссоциации мокроты в суспензию одиночных клеток.
- Характеристика клеточных субпопуляций с использованием стандартных платформ проточной цитометрии.
- Содействие исследованиям здоровья легких и связанных с ними заболеваний.
Используемые методы
- Определение объемов антител и красителей для окрашивания на основе веса мокроты.
- Проведение подсчета клеток во время инкубации с красителями.
- Использование проточной цитометрии для последующего анализа.
- Характеристика клеточных субпопуляций для получения исследовательских данных.
Основные результаты
- Данный протокол позволяет успешно диссоциировать мокроту в суспензии единичных клеток.
- Достигается точный подсчет клеток, что способствует эффективному проведению проточной цитометрии.
- Получаются данные о состоянии легких и механизмах развития заболеваний.
- Оптимизированный процесс расширяет возможности клинической диагностики.
Выводы
- Данный протокол предлагает надежный метод анализа мокроты.
- В нем решены проблемы, возникавшие ранее при подготовке мокроты для проточной цитометрии.
- Полученные результаты создают основу для дальнейшего изучения заболеваний легких.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный протокол устраняет одну из основных проблем в исследованиях заболеваний легких, позволяя проводить высокопроизводительный количественный анализ мокроты с помощью проточной цитометрии. Он превращает традиционно низкопродуктивный и трудоемкий метод цитологии в масштабируемую и воспроизводимую платформу, подходящую для поиска биомаркеров и валидации мишеней при разработке препаратов для терапии респираторных заболеваний. Этот подход способствует снижению рисков при изучении механизмов заболеваний, обеспечивая иммунофенотипический анализ гемопоэтических и эпителиальных линий с одновременным исключением мешающего клеточного детрита и плоскоэпителиальных клеток.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее открытие и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать клеточную гетерогенность в микроокружении легких для валидации терапевтических мишеней в воспалительных и онкологических путях.
- Операционная ценность: снижает зависимость от специализированного персонала по цитопатологии за счет автоматизированного стандартизированного фенотипирования.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в выборе мишеней путем количественной оценки инфильтрации иммунных клеток и состояний активации эпителия, имеющих значение при ХОБЛ, астме, раке легких и патологии легких после COVID.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает получение количественных многопараметрических данных о популяциях CD45+ и CD45− для стандартизации анализа в рамках кампаний по скринингу лекарственных препаратов.
- Практическая ценность: позволяет осуществлять высокопроизводительную обработку образцов с использованием нормализации реагентов по весу, что повышает воспроизводимость результатов между различными центрами и операторами.
- Повторное использование платформы: подтверждена совместимость с цитометрами Navios EX, LSR II и Lyric, что поддерживает перенос анализа между платформами и использование централизованных основных лабораторий.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная ценность: использование идентификации макрофагов, специфичных для легких, в качестве контроля качества для подтверждения происхождения образца, что повышает уверенность в преемственности данных при переходе от доклинических к клиническим исследованиям.
- Снижение механистических рисков: позволяет осуществлять лонгитюдный мониторинг иммунных и эпителиальных изменений в моделях заболеваний, что помогает при принятии решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») на этапе оптимизации ведущих соединений.
- Прогностическая достоверность: предоставляет готовую к применению биомаркерную основу для оценки взаимодействия с мишенью при легочном воспалении или модуляции микроокружения опухоли.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод вписывается в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, обеспечивая стандартизированное иммунное профилирование образцов легких, что способствует проверке гипотез на ранних этапах поиска и механистической валидации на доклинических стадиях.
- Открывающая биология: способствует исследованию иммунного ландшафта легких и стромальных взаимодействий в моделях заболеваний на основе выдвинутых гипотез.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные показатели клеточных ответов, подходящие для скрининга библиотек соединений и анализа взаимодействия с мишенями.
- Аналитика: генерирует многопараметрические данные проточной цитометрии, позволяющие проводить статистическое сравнение эффектов терапии между экспериментальными группами.
- Трансляционные исследования: поддерживает согласование биомаркеров посредством гейтинга по специфическим линиям и исключения нежизнеспособных или contaminating-клеток на основе анализа жизнеспособности.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает стандартизированный, нормализованный по весу рабочий процесс, который может быть развернут на нескольких площадках и платформах приборов для согласованной генерации данных.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения шума, вызванного клеточным детритом и контаминацией плоскоклеточным эпителием.
- Операционная ценность: увеличивает пропускную способность и воспроизводимость за счет дозирования реагентов на основе веса мокроты и использования стандартизированных стратегий гейтирования.
- Стратегическая ценность: позволяет быстрее принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки препаратов для лечения респираторных заболеваний благодаря получению количественных данных об иммунных и эпителиальных фенотипах.
- Влияние на портфель: способствует продвижению проектов с учетом рисков за счет генерации трансляционных данных о биомаркерах, полученных из неинвазивных образцов легких.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области компенсации при проточной цитометрии, гейтирования и иммунофенотипирования первичных клеток человека.
- Зависит от наличия проточных цитометров с соответствующим детектированием флуоресценции и разрешением по рассеянию.
- Необходимо стандартизировать протоколы окрашивания и показатели контроля качества (например, нормализацию по бусинам NIST) во всех центрах.
- Требуется адаптация панелей антител с учетом биологии мишени при сохранении жизнеспособности клеток и гейтирования синглетов.
- Ограничено качеством образцов и вязкостью мокроты, что может повлиять на эффективность диссоциации и выход клеток.
