Анализ мокроты с контролем качества с помощью проточной цитометрии
August 9th, 2021
Этот протокол описывает эффективный метод диссоциации мокроты на одноклеточную суспензию и последующую характеристику клеточных подмножеств на стандартных проточных цитометрических платформах.
Этот протокол решает общие проблемы, возникающие при обработке мокроты, которые в прошлом затрудняли использование с проточной цитометрией для высокопроизводительных клинических диагностических целей. Этот протокол предназначен для экономии времени за счет использования веса мокроты для определения объемов окрашивания антител и красителей. Во время окрашивания инкубации может быть выполнен подсчет клеток для последующих этапов.
Важно достичь точного количества клеток, чтобы определить правильный объем повторной суспензии, чтобы предотвратить любые проблемы при работе на проточном цитометре. Этот протокол может дать представление о областях исследований, которые исследуют здоровье легких. Например, могут быть изучены такие заболевания, как ХОБЛ, астма, рак легких или последствия COVID.
Демонстрировать процедуру будет доктор Майкл Лай, ученый-исследователь из моей лаборатории. Для начала взвесьте образец мокроты, чтобы определить объемы диссоциационных реагентов. Перенесите образец в сосуд соответствующего размера в зависимости от веса мокроты, затем добавьте один миллилитр на грамм 0,5% NAC и четыре миллилитра на грамм 0,1% DTT.
Вращайте образцы на максимальной скорости в течение 15 секунд и породу на максимальной скорости в течение 15 минут при комнатной температуре. Разбавьте этот образец 4X сбалансированным солевым раствором Хэнкса или HBSS для нейтрализации NAC и DTT. А после быстрого вихря качайте образец при комнатной температуре в течение пяти минут.
Фильтрационная клеточная суспензия через 100-микрометровый нейлоновый сетчатый сетчатый фильтр в одну или несколько конических центрифужных трубок по 50 миллилитрам для создания одноэлектрической суспензии. Гранулируйте ячейки. После аспирации супернатанта смешайте гранулы в одной конической трубке объемом 15 миллилитров и промывайте HBSS в тех же условиях.
Повторно суспендируют ячейку гранулы в объеме буфера, определяемом начальным весом образца мокроты. Возьмите аликвоту из клеточной суспензии и смешайте 10 микролитров разведения мокроты с 30 микролитрами 0,4% трипанового синего цвета, затем загрузите в счетные камеры гемоцитометра для подсчета живых/мертвых клеток. Этикетирование мокроты в компенсационных трубках.
Добавьте антитела HBSS и краситель в каждую трубку клетки мокроты и компенсационные трубки, как указано в тексте. Добавьте ячейки мокроты в пробирки и добавьте компенсационные шарики к компенсационным трубкам, как указано в тексте. Высиживать все тюбики на льду, защищенном от света, в течение 35 минут.
Затем, заполнив трубки ледяным холодом HBSS, центрифугируют при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут в 800 раз больше G. Для компенсационных трубок аспирируйте супернатант как можно ближе к гранулам и щелкните гранулами, чтобы ослабить. Затем добавьте 0,5 миллилитра холодного HBSS в компенсационные трубки и храните трубки на льду в легкой защищенной зоне до тех пор, пока не понадобится анализ проточной цитометрии. Затем аспирируют супернатант из неокрашенной мокроты, изотипа, крови и эпителиальных трубок.
Ослабьте гранулы, щелкнув трубками. Добавьте два миллилитра 1% PFA к неокрашенным и изотипным пробиркам и 10 миллилитрам в кровь и эпителиальные трубки. Инкубируйте трубки на льду в светозащитной манере в течение 30 минут, затем быстро вихрьте на максимальной скорости и снова высиживайте еще 30 минут.
Затем наполните трубки ледяным холодом HBSS. Далее центрифугируют трубки при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут в 1,600 раз больше G.Аспират как можно больше супернатанта, не нарушая гранулу клетки, и щелкают трубкой пальцами, чтобы ослабить клетки, затем добавляют 200 микролитров холодного HBSS в неокрашенные и изотипные трубки. Рассчитайте и сложите необходимый объем HBSS для повторного суспензии крови и эпителиальной трубки в соответствии с общим количеством клеток.
Храните все образцы в компенсационных трубках, защищенных от света на льду при четырех градусах Цельсия, до тех пор, пока не будет выполнен анализ проточной цитометрии. Примените соответствующие процедуры запуска для используемого проточного цитометра. Используйте смесь бусин Национального института стандартов и технологий или NIST, чтобы гарантировать, что напряжения прямого рассеяния и бокового рассеяния установлены для размещения бусин NIST для охвата участка, не помещая бусины слишком близко к осям.
Установите скорость потока на среднюю для LSRII или высокую для Navios EX. Отрегулируйте напряжение для каждого параметра, используемого для параметров рассеяния и флуоресцентных параметров, чтобы поместить популяции клеток в масштабе. Используйте цифры со стратегией гатинга в качестве руководства для соответствующей регулировки напряжения. Сначала соберите данные для неокрашенного образца мокроты, затем образца, окрашенного изотипом, а затем пробирки крови и эпителиальной трубки.
Масса мокроты использовалась для определения объемов антител или красителей для окрашивания. Корреляция между массой мокроты и выходом клеток не была сильной. Образцы мокроты были разделены на четыре весовые категории, которые группировались в распределении выхода клеток.
Каждое использованное антитело титровали в концентрации на фазе плато с самым высоким индексом окрашивания, выбранным в качестве рабочей концентрации. Во всех весовых категориях среднее загрязнение SEC составляло менее 20% при процентном соотношении жизнеспособных клеток. Представлена стратегия гатинга, используемая для анализа.
Бусины NIST использовались для установки ворот, которые были применены к образцу мокроты для устранения мусора. Мелкий мусор был дополнительно устранен шириной ворот. Краситель жизнеспособности использовался для устранения мертвых клеток, в то время как синглетные ворота удаляли дублеты.
Маркировка антител против CD45 позволила разделить живые одиночные клетки мокроты на клетку крови и некремянный клеточный компартмент. Сравнивались профили, полученные от Navios EX, LSRII и Lyric. Показана стратегия уничтожения мусора, мертвых клеток, дублетов и сравнения профилей крови и не крови.
Эта методика позволила применить эти методы для выявления риска рака легких для использования в качестве неинвазивного клинического теста.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Этот протокол решает распространенные проблемы, возникающие при обработке мокроты, облегчая ее использование с цитометрией потока для высокопроизводительных клинических диагностик. Он подчеркивает важность точного подсчета клеток и объема взвешивания для успешного анализа с помощью цитометрии потока.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Цитометрия потока
- Клеточная биология
- Исследования здоровья легких
Предыстория
- Обработка мокроты исторически представляла проблемы для цитометрии потока.
- Точный подсчет клеток является важным для эффективного анализа.
- Области исследования включают ХОБЛ, астму, рак легких и COVID-19.
- Этот протокол направлен на оптимизацию анализа мокроты для клинических диагностик.
Цель исследования
- Предоставить эффективный метод для диссоциации мокроты в одноклеточную суспензию.
- Характеризовать клеточные подгруппы с использованием стандартных платформ цитометрии потока.
- Улучшить исследования здоровья легких и связанных с ним заболеваний.
Используемые методы
- Определение объемов антител и окрашивающих красителей на основе веса мокроты.
- Проведение подсчета клеток во время инкубации при окрашивании.
- Использование цитометрии потока для последующего анализа.
- Характеристика клеточных подгрупп для получения исследовательских знаний.
Основные результаты
- Протокол успешно диссоциирует мокроту в одноклеточные суспензии.
- Достигается точный подсчет клеток, что облегчает эффективную цитометрию потока.
- Предоставляются знания о здоровье легких и механизмах заболеваний.
- Оптимизированный процесс улучшает возможности клинической диагностики.
Выводы
- Этот протокол предлагает надежный метод для анализа мокроты.
- Он решает предыдущие проблемы при обработке мокроты для цитометрии потока.
- Результаты поддерживают дальнейшие исследования связанных с легкими заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a key bottleneck in lung disease research by enabling high-throughput, quantitative analysis of sputum via flow cytometry. It transforms a traditionally low-yield, labor-intensive cytology method into a scalable, reproducible platform suitable for biomarker discovery and target validation in respiratory therapeutics. The approach supports mechanistic de-risking by providing immunophenotypic resolution of hematopoietic and epithelial lineages while excluding confounding debris and squamous epithelial cells.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cellular heterogeneity in lung microenvironment to validate therapeutic targets in inflammatory and oncologic pathways.
- Operational Value: Reduces reliance on specialized cytopathology personnel through automated, standardized phenotyping.
- Predictive Value: Supports target confidence by quantifying immune cell infiltration and epithelial activation states relevant to COPD, asthma, lung cancer, and post-COVID lung pathology.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, multiparametric readouts of CD45+ and CD45− populations for assay standardization across drug screening campaigns.
- Operational Value: Enables high-throughput sample processing using weight-based reagent normalization, improving reproducibility across sites and operators.
- Platform Reuse: Demonstrated compatibility across Navios EX, LSR II, and Lyric cytometers, supporting cross-platform assay transfer and centralized core lab utilization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Uses lung-specific macrophage identification as a quality control to confirm sample origin, enhancing confidence in preclinical-to-clinical continuity.
- Mechanistic De-risking: Enables longitudinal monitoring of immune and epithelial shifts in disease models, supporting go/no-go decisions in lead optimization.
- Predictive Confidence: Provides a biomarker-ready framework for evaluating target engagement in pulmonary inflammation or tumor microenvironment modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling standardized immune profiling of lung-derived samples, supporting hypothesis testing in early discovery and mechanistic validation in preclinical stages.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven exploration of lung immune landscapes and stromal interactions in disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cellular readouts suitable for compound library screening and target engagement assays.
- Analytics: Generates multiparametric flow cytometry data enabling statistical comparison of treatment effects across experimental groups.
- Translational Research: Supports biomarker alignment through lineage-specific gating and viability-based exclusion of nonviable or contaminating cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, weight-normalized workflow that can be deployed across multiple sites and instrument platforms for consistent data generation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing noise from debris and squamous epithelial contamination.
- Operational Value: Improves throughput and reproducibility via sputum weight-based reagent dosing and standardized gating strategies.
- Strategic Value: Enables faster, data-driven go/no-go decisions in respiratory drug programs by providing quantifiable immune and epithelial phenotypes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by generating translatable biomarker data from non-invasive lung samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry compensation, gating, and immunophenotyping of primary human cells.
- Dependent on access to flow cytometers with adequate fluorescence detection and scatter resolution.
- Necessitates standardization of staining protocols and QC metrics (e.g., NIST bead normalization) across sites.
- Requires adaptation of antibody panels based on target biology while maintaining viability and singlet gating.
- Limited by sample quality and sputum viscosity, which may affect dissociation efficiency and cell yield.
