Эффективность бактериофагов для биоконтроля патогенов пищевого происхождения, оцененная с помощью высокопроизводительных настроек
19 августа 2021 г.
Этот протокол описывает надежный метод использования высокопроизводительных настроек для скрининга антибактериальной эффективности коктейлей бактериофагов.
Этот простой в исполнении протокол оценивает антибактериальную эффективность различных комбинаций бактериофагов, также известных как фаговые коктейли, в различных условиях в условиях высокой пропускной способности. Основными преимуществами метода является способность передавать различные биотики и абиотические факторы, такие как температура, которые могут влиять на эффективность фагов в различных условиях окружающей среды. Этот метод может облегчить разработку соответствующих фаговых коктейлей для усиления биоконтроля и терапевтических результатов и определения взаимодействия между бактериальными хозяевами и бактериофагами.
Для начала настройте анализ микропластины с использованием отфильтрованных наконечников, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Сначала добавляют 180 микролитров mTSB в колодцы колонн от одной до 12 из 96-луночной микропластины, затем готовят последовательные десятикратные разбавления каждого фага в колоннах от одной до восьми стерильных 96-луночных микропластин для настройки анализа. Добавьте 20 микролитров отдельных фагов или фаговых коктейлей в колодцы от одного до восьми верхнего ряда А микропластины.
Для бесфагового и пустого контроля добавьте 20 микролитров mTSB в верхнюю скважину колонн с девяти до 12. Во время пипетки смешайте содержимое лунки с мягким и повторным аспирацией не менее пяти раз и меняйте наконечники между разведениями. Удалите 20 микролитров из последнего ряда H, затем создайте резервуар для испытуемого бактериального штамма, перенеся два-три миллилитра разбавленной культуры в резервуар с помощью одной миллилитровой пипетки.
Используя многоканальную пипетку, добавьте 20 микролитров разбавленной бактериальной культуры в каждую лунку в колонках от одного до 10, меняя наконечники между каждым добавлением. Накройте и высиживайте микропластинку при температуре 37 градусов Цельсия. С интервалом в два часа извлеките микропластинку из инкубатора и считайте пластину с помощью считывателя микропластин.
В качестве альтернативы, инкубируйте пластину в считывателе микропластин и считывайте ее с течением времени. Чтобы исследовать оптическую плотность на 600 нанометров с помощью считывателя микропластин, откройте программу на микропластинчатом считывателе. Выберите Простой режим в окне параметров запуска, а затем выберите Создать новый протокол в диспетчере задач.
В окне Выбор типа пластины выберите из раскрывающегося списка пластину с 96 лунками. В качестве метода обнаружения выберите «Поглощение» для типа считывания, выберите параметр «Конечная точка/кинетическая точка» для типа оптики, выберите «Монохроматоры» и нажмите кнопку «ОК». В поле Шаг чтения введите 600 нанометров для длин волн, выберите Нормальный для скорости считывания и нажмите OK.To установить температуру для анализа, установите флажок Инкубатор и выберите Инкубатор вкл.Введите желаемую температуру в поле температуры, а затем нажмите кнопку ОК. Нажмите на флажок Предварительный нагрев, прежде чем продолжить следующий шаг для температуры инкубации 37 градусов по Цельсию, хотя опция не требуется для условий испытаний при 22 градусах Цельсия. Чтобы предотвратить конденсацию на крышке пластины во время инкубации, установите градиент температуры, введя значение в поле градиента и нажмите кнопку ОК. Затем установите флажок Кинетический, чтобы открыть кинетическую установку.
Установите время выполнения на 10 часов для инкубации 37 градусов Цельсия или 22 часа для комнатной температуры и введите два часа в качестве интервала считывания, затем нажмите OK. Установите флажок Встряхнуть в окне процедуры, чтобы настроить условие встряхивания, если это необходимо для каждого кинетического чтения. Выберите Линейный режим в режиме встряхивания и измените длительность на 30 секунд. Установите значение линейной частоты равным 731 циклу в минуту, а затем щелкните OK.In диалоговом окне Сводка протокола, щелкните Макет пластины, выберите Пробелы, Элементы управления анализом и Образцы и нажмите кнопку Далее.
После определения настроек для каждого типа скважины нажмите кнопку Готово. Выберите идентификатор скважины в левом интерфейсе, назначьте его матрице, показанной в окне «Макет пластины», затем нажмите «ОК». Нажмите кнопку Read Plate, сохраните протокол в виде prt-файла и нажмите «Сохранить». Вставьте пластину и нажмите OK. После завершения эксперимента сохраните его в виде файла xpt и нажмите кнопку Сохранить.
Экспортируйте данные в Excel, нажав кнопку Да в окне окна сообщения для дальнейшего анализа. Нажмите на выбор Сохранить Да/Нет и установите флажок Не спрашивать снова, чтобы сохранить настройки. Следуя протоколу, было проведено сравнение эффективности фагов с различными комбинациями фагов, температурой, временем и множественностью инфекций или MOI.
Основываясь на этом анализе, эффективность фагов анти-O157 была максимизирована после 14, 16 или 18 часов инкубации при 22 градусах Цельсия. Для понимания кинетики бактерий, убивающей фаги, значения OD на уровне 600 нанометров были построены по времени отбора проб, MOI и обработке фагов. Показаны репрезентативные кривые роста бактерий при 37 градусах Цельсия.
T4 полностью ингибировал рост бактерий в каждый раз отбора проб даже при низком MOI. Чтобы проанализировать фаговы, ингибирующие рост бактерий, средние значения OD из всех MOI были построены по каждому времени отбора проб и обработке фагом. Репрезентативные графики при двух температурах показали, что эффективность уничтожения фагов, например, для T1 плюс T4 была повышена при 22 градусах Цельсия по сравнению с 37 градусами Цельсия.
Показано сравнение общей эффективности фагов, что облегчает определение наилучшей фазы лечения. Например, для штамма Escherichia coli 3081 лечение фагами Т4 и Т5 плюс Т4 было наиболее эффективным лечением при 37 градусах Цельсия. Однако при 22 градусах Цельсия, в дополнение к Т4, фаг Т1 плюс Т4, Т1 плюс Т4 плюс rV5 и четыре фаговых коктейля были эффективными.
При выполнении этой процедуры чрезвычайно точное пипетирование, особенно при использовании многоканальной пипетки, и единообразие подхода имеют важное значение для получения сопоставимых и интерпретируемых результатов. Последующие эксперименты необходимы для оценки дальнейшей эффективности наиболее влиятельного коктейля в скрининге, предотвращая появление антифаговых мутантов в обширной системе культивирования бульона и других биологических матрицах.
Обзор
В данном протоколе описан надежный метод использования высокопроизводительных настроек для скрининга антибактериальной эффективности коктейлей бактериофагов. Этот метод позволяет оценивать различные комбинации фагов при различных условиях для улучшения терапевтических результатов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Фаготерапия
- Антибактериальный скрининг
Теоретические сведения
- Бактериофаги представляют собой вирусы, которые инфицируют бактерии и могут быть использованы в качестве средств биологического контроля.
- Фаговые коктейли позволяют повысить эффективность лечения бактериальных инфекций.
- Высокопроизводительный скрининг позволяет одновременно оценивать множество условий.
- Понимание взаимодействия между фагами и бактериями-хозяевами имеет решающее значение для проведения эффективной терапии.
Цель исследования
- Оценка антибактериальной эффективности различных коктейлей фагов.
- Определение влияния факторов окружающей среды на эффективность фагов.
- Оптимизация разработки схем фаговой терапии бактериальных инфекций.
Используемые методы
- Подготовка микропланшета для анализа с серийными разведениями фагов.
- Инкубация микропланшетов при контролируемых температурах.
- Измерение оптической плотности при 600 nm для оценки роста бактерий.
- Анализ данных для сравнения эффективности фагов при различных условиях.
Основные результаты
- Фаг T4 эффективно подавлял рост бактерий при низкой множественности заражения (MOI).
- Оптимальная эффективность фагов наблюдалась при определенных временах и температурах инкубации.
- Фаговые коктейли демонстрировали различную эффективность в зависимости от бактериального штамма и условий.
- Точное дозирование с помощью пипеток и единообразие подхода имели решающее значение для получения достоверных результатов.
Выводы
- Данный метод обеспечивает систематический подход к оценке коктейлей фагов.
- Необходимы дальнейшие исследования для оценки эффективности наиболее действенных комбинаций фагов.
- Понимание взаимодействий между фагами и бактериями может привести к совершенствованию терапевтических стратегий.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Систематическая высокопроизводительная оценка коктейлей бактериофагов позволяет проводить быстрый количественный анализ антибактериальной эффективности против пищевых патогенов в различных условиях окружающей среды. Данный подход обеспечивает прогностическую уверенность при выборе агентов биоконтроля и снижает риски при принятии решений на ранних этапах формирования портфеля новых антибактериальных стратегий. Интеграция надежных данных скрининга ускоряет переход от стадии поиска к созданию масштабируемых решений для биоконтроля в области безопасности пищевых продуктов и сельскохозяйственной биотехнологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Обеспечивает возможность количественного анализа взаимодействий фагов и бактерий для различных штаммов и условий.
- Поддерживает функциональную валидацию перспективных коктейлей фагов для направленного контроля патогенов.
- Способствует механистическому снижению рисков за счет выявления зависимости эффективности фагов от условий окружающей среды.
- Обеспечивает приоритезацию на основе данных для дальнейшей разработки агентов биологического контроля.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированный и воспроизводимый анализ в микропланшетах для высокопроизводительного скрининга эффективности фагов.
- Позволяет получать количественные показатели оптической плотности для прямого сравнения вариантов обработки фагами.
- Обеспечивает возможность масштабируемой оценки комбинаций фагов, MOI и переменных условий окружающей среды.
- Подготавливает валидированные биологические системы для последующей оптимизации и рабочих процессов по разработке рецептур.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит результаты скрининга в соответствие с требованиями трансляционных исследований в области безопасности пищевых продуктов и сельскохозяйственного биоконтроля.
- Обеспечивает преемственность перехода от обнаружения in vitro к доклинической валидации в соответствующих матрицах.
- Обосновывает дальнейшее внедрение фаговых коктейлей с наилучшими профилями эффективности с учетом оценки рисков.
- Предоставляет данные о механизмах действия для разработки стратегий управления резистентностью.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Этот метод высокопроизводительного скрининга связывает этапы первичного поиска и идентификации перспективных соединений для биоконтроля на основе фагов, обеспечивая выбор и оптимизацию коктейлей-кандидатов на основе полученных данных.
- Биологические исследования: Позволяет количественно оценить взаимодействия между фагом и бактерией и выяснить факторы эффективности при различных условиях.
- Скрининг: Стандартизирует условия анализа и обеспечивает воспроизводимую масштабируемую оценку эффективности фагов.
- Аналитика: Обеспечивает кинетические измерения оптической плотности для надежного статистического сравнения вариантов обработки.
- Трансляционные исследования: Облегчают переход от скрининга in vitro к доклинической оценке в контексте безопасности пищевых продуктов.
- Практическое применение: Создает многократно используемую платформу для постоянной оптимизации коктейлей фагов и мониторинга резистентности.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования при выборе фагов и снижает механистическую неопределенность в эффективности биоконтроля.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов антибактериального скрининга.
- Стратегическая ценность: обеспечивает обоснованное принятие решений о продолжении или прекращении разработки, а также экономически эффективное продвижение кандидатов для биоконтроля.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию с учетом рисков и продвигать фаговые коктейли с наилучшими профилями эффективности.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области микробиологии, биологии фагов и разработки количественных методов анализа.
- Необходим доступ к микропланшетным ридерам, оборудованию для контролируемой инкубации и инфраструктуре для анализа данных.
- Для обеспечения воспроизводимости требуются строгая техника пипетирования и стандартизация процессов между членами команды.
- Может потребоваться адаптация метода для различных бактериальных штаммов или природных матриц.
- Для трансляционного внедрения необходима последующая валидация в более крупных или сложных биологических системах.
