Светоиндуцированная экспрессия GFP у эмбрионов рыбок данио с использованием оптогенетической системы TAEL/C120
19 августа 2021 г.
Оптогенетика является мощным инструментом с широким спектром применения. Этот протокол демонстрирует, как достичь индуцируемой светом экспрессии генов у эмбрионов рыбок данио с использованием системы TAEL/C120, реагирующей на синий свет.
Этот протокол важен, потому что это оптогенетический или активированный светом метод для индуцирования экспрессии генов в интактном организме. В нашем случае эмбрион рыбки данио. Преимущество этого метода заключается в том, что он использует свет в качестве индуцатора, что позволяет очень точно, пространственно и временно контролировать индукцию.
Этот протокол был бы полезен для любой ситуации, когда индуцируемая экспрессия генов была бы полезна. Это включает в себя такие вещи, как отслеживание родословной, анализы на получение функции или спасательные эксперименты. Для начала расположите светодиодную панель относительно чаш Петри, содержащих эмбрионы, для доставки 1,5 милливатт на квадратный сантиметр мощности света сразу нескольким эмбрионам.
Для снижения риска повреждения фотографии активатора tail Transcriptional, размещайте свет с интервалом в один час включения-выключения с помощью реле таймера, если оно освещено более трех часов. Снимите крышки чашки Петри, чтобы свести к минимуму рассеяние света от конденсации. Поместите чашки Петри, содержащие контрольные эмбрионы, и светонепроницаемый ящик для темных элементов управления.
Удалите эмбрионы из иллюминации, после желаемой продолжительности активации. Для полной экстракции РНК используйте набор для экстракции РНК. Перенесите эмбрионы в 1,5-миллилитрную микроцентрифужную трубку и удалите лишнюю яичную воду.
После добавления буфера лизиса гомогенизируйте эмбрионы пластиковым пестиком. Перенесите лисат в комплект, предусмотренный колонкой, и следуйте инструкциям производителя по очистке РНК. Храните очищенную РНК при температуре от минус 20 до минус 80 градусов Цельсия до момента использования или немедленно синтезируйте кДНК из одного микрограмма, общей РНК с использованием набора синтеза кДНК, следуя инструкции производителя.
Добавьте один микрограмм РНК в тонкую стенку 0,2 миллилитра, ПЦР-трубку, содержащую четыре микролитра, пятикратной мастер-смеси реакции кДНК, с последующим добавлением одного микролитра, 20-кратного раствора фермента обратной транскриптазы. Затем составьте окончательный объем в 20 микролитров, с водой без нуклеаз. Поместите трубку в программированный термоциклер для синтеза кДНК.
Храните синтезированную кДНК при минус 20 градусах Цельсия до момента использования или немедленного использования для количественной оценки. Настройте количественные реакции ПЦР, содержащие кибер-зеленую ферментную мастер-смесь. Пятикратно разбавляют праймеры кДНК и ГФП при 325 наномолярной концентрации в трипликатах и проводят реакцию в запрограммированной машине ПЦР реального времени.
По завершении реакции проанализируйте кривую расплава для определения специфичности реакции. Рассчитайте индукцию, активируемую светом, по мере изменения складок относительно контрольных эмбрионов с помощью метода двойной дельта-КТ. И использовать статистическое программное обеспечение для определения значимости.
После удаления эмбрионов из освещения обездвиживайте эмбрионы для визуализации в 3% метилцеллюлозе, содержащей 0,01% трикаина в стеклянных депрессивных слайдах. Получайте флуоресцентные и яркие изображения на флуоресцентном стереомикроскопе, подключенном к цифровой камере, с помощью стандартных настроек фильтра GFP. Объединяйте изображения яркого поля и флуоресценции после получения с помощью программного обеспечения для обработки изображений.
Количественная оценка экспрессии GFP показала индукцию экспрессии уже через 30 минут после воздействия синего света. Затем уровни экспрессии GFP продолжали увеличиваться до шести часов, после активации неуклонно. Индукция GFP также была качественно оценена путем изучения интенсивности флуоресценции в то же время в точках после активации.
Флуоресценция GFP выше фоновых уровней впервые наблюдалась через три часа после активации и стала заметно ярче через шесть часов после активации. В отличие от контрольных эмбрионов за все временные точки, хранимые в темноте, не проявляли какой-либо заметной флуоресценции GFP. Активирующий свет должен находиться в синем диапазоне спектра видимого света.
Как свет комнаты, так и солнечный свет содержат некоторое количество синего света. Поэтому позаботьтесь о защите ваших негативных элементов управления от любых источников окружающего освещения. Система TAEL C120 генетически закодирована и модульна и может управлять экспрессией любого гена, представляющим интерес.
Таким образом, в сочетании с другими методами, он может быть использован для ответа на ряд биологических вопросов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Этот протокол демонстрирует использование оптогенетики для достижения свето-индуцируемой генной экспрессии в эмбрионах даnio рерио. Система TAEL/C120, чувствительная к синему свету, позволяет точно контролировать генную экспрессию в целостном организме.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Оптогенетика
- Генная экспрессия
- Модели дани рерио
Бэкграунд
- Оптогенетика - это светоактивируемый метод для индукции генной экспрессии.
- Эта техника обеспечивает пространственный и временной контроль индукции.
- Она особенно полезна для линейного трассировки и анализа функции гена.
- Эмбрионы дани рерио служат моделью для исследования генной экспрессии in vivo.
Цель исследования
- Демонстрировать метод свето-индуцируемой генной экспрессии.
- Предоставить протокол для исследователей, заинтересованных в оптогенетических приложениях.
- Обеспечить точный контроль генной экспрессии в экспериментах.
Используемые методы
- Размещение светодиодного панеля относительно чашек Петри с эмбрионами.
- Подача 1,5 милливатт на квадратный сантиметр света.
- Индуцирование генной экспрессии в нескольких эмбрионах одновременно.
- Использование оптогенетической системы TAEL/C120 для контроля генов.
Основные результаты
- Успешное индуцирование генной экспрессии в эмбрионах дани рерио.
- Демонстрируемый пространственный и временной контроль за активацией генов.
- Предоставленный надежный протокол для будущих оптогенетических исследований.
- Показаны преимущества использования света в качестве индуктирующего агента.
Выводы
- Оптогенетика предлагает мощный инструмент для изучения функции генов.
- Система TAEL/C120 эффективна для индукции генной экспрессии in vivo.
- Этот метод может быть применен к различным биологическим исследованиям.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Optogenetic control of gene expression enables precise spatiotemporal interrogation of biological targets in vivo, supporting mechanistic de-risking in early discovery. The TAEL/C120 system provides a genetically encoded, light-switchable platform for validating therapeutic hypotheses with quantitative readouts. This approach enhances predictive confidence in target validation by allowing reversible, dose-dependent modulation of gene expression in zebrafish embryos.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through inducible, reversible gene activation in an intact vertebrate model.
- Operational Value: Supports functional target validation by linking light-induced expression to phenotypic readouts via GFP reporter and qRT-PCR quantification.
- Predictive Value: Facilitates gain-of-function and rescue experiments to assess target sufficiency and pathway relevance in disease-relevant contexts.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, light-dependent GFP expression measurable by fluorescence microscopy and qRT-PCR for compound or condition screening.
- Reproducibility: Enables standardized induction protocols with defined light intensity (1.5 mW/cm²) and temporal control to minimize variability across replicates.
- Scalability: Compatible with multi-well formats using LED panels to treat multiple embryos simultaneously under controlled illumination.
Translational & Preclinical Research
- Disease Modeling: Supports zebrafish-based preclinical models where temporal control of gene expression mimics inducible therapeutic interventions.
- Biomarker Alignment: GFP and qRT-PCR outputs serve as translatable pharmacodynamic readouts for pathway engagement and target modulation.
- Risk Mitigation: Allows de-risking of targets by testing necessity and sufficiency through inducible gain-of-function and rescue designs prior to mammalian studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, enabling iterative validation of molecular targets in a vertebrate system.
- Discovery Biology: Tests target sufficiency and pathway activation through timed, light-induced expression in vivo.
- Screening: Delivers quantitative, normalized outputs (fold-change GFP) for comparing genetic or pharmacological conditions.
- Analytics: Employs double delta CT qRT-PCR and fluorescence intensity for statistical comparison between induced and dark controls.
- Translational Research: Connects inducible expression to phenotypic outcomes in zebrafish, supporting continuity to preclinical efficacy testing.
- Enterprise Reuse: Modular TAEL/C120 system can drive any gene of interest, enabling reuse across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing precise temporal control over gene expression in a complex organism.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized light delivery and internal dark controls to account for environmental variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling rapid, reversible target modulation to assess phenotypic consequences.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by validating targets in a physiologically relevant, inducible system before resource-intensive advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, microinjection, and optogenetic hardware setup.
- Depends on LED illumination systems capable of delivering precise blue light intensity and timing control.
- Necessitates standardized protocols for light exposure duration and dark control maintenance to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when scaling to different embryonic stages or genetic backgrounds.
- Limited by light penetration in opaque tissues, though mitigated in zebrafish embryos due to optical clarity.
