Построение модельных липидных мембран, включающих рецепторы, связанные с G-белком (GPCR)

Этот протокол использует набухание агарозы в качестве мощного и обобщаемого метода включения интегральных мембранных белков (ИМП) в гигантские одноламеллярные липидные везикулы (ГУВ), как описано здесь для восстановления человеческого белка рецептора серотонина 1А (_5-HT1AR), одного из классов фармакологически важных рецепторов, связанных с G-белком.

Изучение интегральных мембранных белков в их родной среде было проблемой из-за сложности плазматической мембраны. Гигантские одноламеллярные липидные везикулы, или GUV, являются одной из наиболее известных платформ для изучения свойств биомембраны, и они могут быть спроектированы для имитации различных физиологических состояний. Этот протокол описывает способ изготовления белковых инкорпорированных ГУВ на основе спонтанного включения после набухания гидрогеля. Традиционные методы изготовления ГУВ не могут быть обобщены для включения интегрального мембранного белка. Эти методы часто являются низкопродуктивными, методологически сложными и специальными, не применимыми к широким классам белков. С другой стороны, этот протокол представляет собой гибкий, надежный и простой метод включения функциональных интегральных мембранных белков в ГУВ.Мы достигли этого, подготовив гидрогелевой каркас, содержащий белок, и нанеся тонкий слой липидов поверх него. В примере, представленном здесь, мы включили рецептор, связанный с G-белком, или GPCR, в ГУВ.При регидратации всей системы ГУВ отходят от поверхности гидрогеля с мембраной, содержащей правильно ориентированные GPCR.Позвольте всем реагентам достичь комнатной температуры. В течение этого времени очистите крышку, поместив их в метанол и обработав ультразвуком в течение 30 минут при 40