Двухслойный мембранный сэндвич-метод для сбора слюны Laodelphax striatellus

Искусственное вскармливание и сбор слюны обеспечивают прямой метод обнаружения эффекторов в слюне насекомых. Однако это не было подробно описано ранее. Этот протокол эффективен для сбора слюны у сапрофитных насекомых.

Кроме того, это простая техника, так как мы используем среду, содержащую только сахарозу, в качестве искусственной диеты. Слюна сапрофитных насекомых может влиять на иммунную систему хозяина, чтобы улучшить пищевое поведение и передать патогены. Это лекарство, которое может быть использовано для поведения насекомых и исследования костного пути насекомых.

Это простой метод для выполнения. Тем не менее, это говорит о создании чистой экспериментальной среды, поскольку слюна собирается для дальнейших исследований. Начните с приготовления 5% раствора сахарозы для искусственной диеты и отфильтруйте раствор через фильтр 0,22 микрона для удаления бактериального загрязнения и примесей.

Голодайте около 200 маленьких коричневых личинок растений в течение трех-пяти часов, прежде чем ввести их в кормовую камеру. Затем, чтобы подготовить стеклянные цилиндры в качестве питательных камер, закройте один открытый конец камеры парафиновой мембраной перед введением экспериментальных насекомых, затем переместите насекомых в стеклянный цилиндр и накройте другой конец камеры растянутой парафиновой мембраной. Добавьте на мембрану 200 микролитров искусственной диеты, затем накройте жидкость еще одним слоем растянутой парафиновой мембраны.

Наконец, накройте камеру алюминиевой фольгой, оставив конец с устройством искусственной диеты, подверженным воздействию света. Через 24 часа соберите слюну SBPH, охладив цилиндр при четырех градусах Цельсия, чтобы обездвижить насекомых, затем раскройте внешнюю пленку и соберите искусственную диету в 1,5 миллилитровые стерильные трубки с помощью стерильной пипетки. Держите собранную слюну при минус 80 градусах Цельсия до анализа.

Затем промыть внутреннюю мембрану 50 микролитрами свежей искусственной диеты три раза, мягко пипеткой, и собрать диету искусственного мытья в 1,5 миллилитра стерильных трубк. После трех полосканий добавьте свежую искусственную диету на внутреннюю мембрану и поместите сверху свеженатянутую парафиновую мембрану. Наконец, фильтруйте собранные образцы через фильтрующий блок 0,22 микрона для удаления микробов и других загрязняющих веществ.

Перенесите коллективные образцы слюны в центробежный фильтр объемом 500 микролитров 10 килодалтонов. Центрифугирование образца. Соберите супернатант и доведите конечный объем до 100 микролитров.

Чтобы измерить концентрацию собранной слюны, включите видимый УФ-спектрофотометр и трижды промойте пьедесталы двухдистиллированной водой. Выберите опции на экране в следующем порядке, белки, белок А280. Выберите тип и одну единицу поглощения, равную одному миллиграмму на миллилитр.

Затем установите флажок для базовой коррекции, 340 нанометров. Далее загрузите два микролитра 5%-ного раствора сахарозы в виде заготовки, затем нажмите Blank в нижней части экрана. Наконец, установив стандарты, загрузите два микролитра собранной слюны и запишите концентрацию белка.

При питании 5% сахарозы более 80% SBPH выживали в течение первых четырех дней. Однако с пятого дня смертность быстро возросла до 40%, а на седьмой день выжило менее половины SBPH. Анализ страницы SDS показал, что концентрированные образцы слюны из РСВ-инфицированной слюны SBPH содержали гораздо больше белков, чем 5% отрицательный контроль сахарозы.

В вестерн-блот-анализе для обнаружения белка RSV капсида, неинфицированных и вирулиферных насекомых. Белок капсида RSV был успешно обнаружен в вирулиферном образце, антитело, разработанное против продукта гена LssgMP, обнаружило белок 78 килодалтон в неинфицированных и вирулиферных образцах, демонстрируя, что LssgMP является белком слюны. QRT-ПЦР-анализ уровней транскрипта LssgMP в разных тканях показал, что уровни транскрипта Lssg в слюнной железе были в 20 раз выше, чем во всем организме и кишечнике, подтверждая специфическую экспрессию LssgMP в слюнной железе.

Голодание подопытных насекомых перед введением их в камеру необходимо для обеспечения эффективности нашего сбора слюны. Кроме того, искусственную среду следует собирать и обменивать каждые 24 часа, чтобы уменьшить микробное загрязнение в собранном образце. Этот метод обеспечивает прямой метод изучения функции слюны в передаче патогенов.

Кроме того, это может помочь изучить взаимодействие насекомых-патогенов с хозяином.