Удобное, высокопроизводительное и полностью автоматизированное программное обеспечение для сбора данных для одночастичной криоэлектронной микроскопии
July 29th, 2021
Одночастичная криоэлектронная микроскопия требует подходящего программного пакета и удобного для пользователя конвейера для автоматического сбора данных с высокой пропускной способностью. Здесь мы представляем применение полностью автоматизированного программного пакета для сбора изображений Latitude-S и практического конвейера для сбора данных остекленных биомолекул в условиях низких доз.
Автоматизированное программное обеспечение для сбора данных крайне необходимо для сбора огромного количества криозданных для структурной характеристики биологических макромолекулов. Пакет Automated Data Acquisition Software был использован здесь для характеристики структуры различных биологических макромолекулов, которые напрямую связаны с биологией патогенов. Например, микобактерии, ВИЧ и SASCO 2.
Для начала запустите программное обеспечение Latitude-S Automated Data Acquisition Software, щелкнув DigitalMicrograph в меню «Пуск». Затем выберите диспетчер техники, а затем значок Latitude-S для автоматического сбора данных по одной частице. Чтобы создать сеанс на основе параметров предыдущего сеанса, установите флажок на основе предыдущего сеанса в палитре, а затем нажмите кнопку «Новый» или, чтобы продолжить существующий сеанс, нажмите кнопку «Продолжить».
Чтобы начать совершенно новый сеанс, нажмите на новую вкладку в палитре. Выберите папку, содержащую сеанс, который необходимо продолжить, и выберите папку для сохранения данных. Затем щелкните значок настройки и в появившемся поле просмотра управляемого состояния добавьте состояние, установите условие TEM, условие камеры и параметр изображения или запаса.
Затем присвойте государству имя или откройте сводку настроек состояния, чтобы открыть параметры сохранения. Затем настройте состояние Atlas, щелкнув палитру состояния Atlas, и задайте параметры увеличения, условий освещения и времени экспозиции камеры, а затем нажмите next, чтобы перейти к следующему состоянию. Затем настройте состояние сетки, щелкнув палитру состояния сетки, установите параметры для оптики визуализации микроскопа, условия освещения и время экспозиции камеры, и нажмите «Далее».
Настройте состояние отверстия, щелкнув по палитре отверстий, и установите оптику изображения, условия освещения, биннинг и параметры времени экспозиции камеры. После нажатия кнопки «Далее» настройте следующее состояние фокусировки, щелкнув палитру фокусировки, и установите параметры микроскопа для оптики изображения, условий освещения, биннинга и времени экспозиции камеры. Затем сосредоточьтесь на аморфной углеродной области рядом с отверстием и нажмите далее, чтобы перейти к следующему состоянию.
Настройте состояние данных, щелкнув по палитре данных и задав параметры для параметров микроскопа, затем нажмите «Далее». Нажмите на палитру конфигурации фокусировки, указав диапазон значений расфокусировки и размер шага в данной вкладке, и нажмите следующую кнопку, чтобы перейти к следующему шагу. Сосредоточьтесь на необходимых функциях на сетке и нажмите кнопку захвата.
Затем поместите знак красного креста на один и тот же объект на каждом изображении разных состояний. Начните с состояний Фокус, Данные и Дыра, потому что поле зрения больше, чем состояния Атласа и Сетки. Затем увеличьте масштаб состояний Atlas и Grid, чтобы расположить красный крестик на том же объекте.
Чтобы вычислить позиции и смещение между каждым из пяти различных состояний и отразить позиции и смещения в окне вывода, нажмите кнопку вычисления. Нажмите на палитру захвата и выберите размер атласа, чтобы охватить всю сетку или часть сетки в зависимости от требования. Чтобы захватить Атлас, перейдите по Атласу и выберите квадрат сетки в зависимости от толщины льда.
После того, как нужные квадраты сетки выбраны, нажмите кнопку расписания и наблюдайте, как плитки в квадрате сетки заполняются по мере захвата каждого квадрата сетки. После нажатия кнопки расписания выберите репрезентативное отверстие в квадрате сетки, добавив положение отверстия. После получения изображения отверстия определите данные и позиции фокусировки и сохраните макет в качестве шаблона.
Нажмите на автоматический поиск, введите размер отверстия и нажмите кнопку поиска в программе, чтобы автоматически найти отверстия на основе диаметра. Установите интенсивность для удаления отверстий из сетки квадрата и загрязнения льдом. А после добавления выбранных и желтых инструментов меток через автонайс, нажмите на кнопку расписания в локаторных задачах.
В соответствии с первоначальным ручным скринингом микроснимков с коррекцией движения с использованием программного обеспечения cisTEM, большинство данных оказались в пределах желаемого диапазона сигнала. Кроме того, изображения, собранные в диапазонах расфокусировки, также были вручную проверены cisTEM. Частицы шипов были выбраны вручную для расчета средних значений 2D-класса для структурной визуализации, что настоятельно предполагалось, но структурная характеристика с высоким разрешением была возможна с использованием соответствующего набора данных.
3D-классификация показала, что Spike Protein имеет 1RBD в открытом подтверждении и все другие RBD в подтверждении закрытия. Открытые подтверждения спайкового белка 1RBD были реконструированы с использованием симметрии C1. Карта Spike Protein представлена в боковых верхних и нижних видах.
А эм-карта оснащена атомной структурой для лучшей визуализации боковых цепей. Близкие подтверждения RBD были уточнены с помощью симметрии C3 и улучшенной 3D-модели и ЭМ-карты, оснащенной атомной структурой, как показано на рисунке. А промежуточное подтверждение спайкового белка, идентифицированного как поддомен S2, указывало на боковые цепи отдельных аминокислотных остатков.
Результаты показали, что Latitude-S может собирать криоэм-данные высокого разрешения биологических макромолекул. Это автоматизированное программное обеспечение для сбора данных может быть использовано в любой другой системе электронной микроскопии для автоматического сбора данных.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
В этой статье рассматривается внедрение Latitude-S, автоматизированного программного обеспечения для сбора данных в криоэлектронной микроскопии. Особое внимание уделяется важности пользовательской линии для сбора данных с высокой пропускной способностью биомолекул.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Криоэлектронная микроскопия
- Структурная биология
- Автоматизированный сбор данных
Описание
- Одночастичная криоэлектронная микроскопия имеет решающее значение для структурной характеристики.
- Для эффективного сбора данных необходимо автоматизированное программное обеспечение.
- Стекловидные биомолекулы требуют условий изображения с низкой дозой.
- Биология патогенов является значимой областью применения.
Цель исследования
- Презентация полностью автоматизированного программного пакета для сбора изображений.
- Создание практической линии для сбора данных.
- Повышение эффективности рабочих процессов криоэлектронной микроскопии.
Используемые методы
- Использование программного обеспечения Latitude-S для автоматизированного сбора данных.
- Настройка сессий на основе предыдущих настроек.
- Техники изображения с низкой дозой для биомолекул.
- Характеристика различных биологических макромолекул.
Основные результаты
- Успешная реализация Latitude-S для сбора данных с высокой пропускной способностью.
- Эффективная характеристика структур, связанных с патогенами, такими как микобактерии и ВИЧ.
- Упорядоченный рабочий процесс для автоматизированного сбора данных.
- Демонстрируемая способность программного обеспечения в условиях низкой дозы.
Выводы
- Latitude-S значительно улучшает эффективность криоэлектронной микроскопии.
- Автоматизированный сбор данных необходим для исследований в области структурной биологии.
- Программное обеспечение облегчает исследование важных биологических макромолекул.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Automated data acquisition in cryo-EM enables high-throughput structural characterization of pathogen-associated macromolecules, supporting target validation and lead identification in early discovery. The Latitude-S software streamlines workflow efficiency, reducing manual intervention and increasing data reproducibility for structural biology teams. This capability enhances predictive confidence in mechanistic de-risking by providing reliable, quantitative structural data for infectious disease targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through high-resolution structural visualization of pathogen proteins like SARS-CoV-2 spike.
- Operational Value: Supports biological de-risking by clarifying conformational states and functional mechanisms of macromolecular targets.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by delivering atomic-resolution data that informs target druggability and mechanism of action.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating consistent, high-quality cryo-EM datasets.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through fully automated imaging under controlled low-dose conditions.
- Scalability: Enables screening readiness and platform reuse, as demonstrated by acquisition of ~3,000 movie images in a single 48-hour session.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from discovery through preclinical validation by providing structural insights into pathogen biology.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by identifying conformational states (e.g., 1-RBD up/open and all RBD down/closed) that inform functional assays.
- Risk-Adjusted Advancement: Connects structural data to decision-making for target prioritization in antiviral development programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization, where structural data informs hit-to-lead progression and mechanism elucidation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling structural characterization of macromolecular complexes involved in pathogen entry and replication.
- Screening: Describes assay readiness through automated, high-throughput data collection that yields quantitative, reproducible outputs for downstream analysis.
- Analytics: Highlights measurements such as defocus values, image quality metrics, and 3D classification outputs that enable comparison of structural states and conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via structural models that inform functional assays and biomarker alignment for pathogen targets.
- Enterprise Reuse: Frames the software as a reusable capability across multiple targets and projects, reducing redundancy in data acquisition setup.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in structural studies of pathogenic macromolecules.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of data acquisition across sessions and users.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early structural insights.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on high-confidence structural data.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in cryo-EM operation, software configuration, and structural data interpretation.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including 200 keV cryo-TEM, direct electron detector, and computing resources for image processing.
- Cross-team standardization requirements for session templates, parameter settings, and data naming conventions.
- Adaptation considerations across model systems, including vitrified samples of varying size, symmetry, and stability.
- Practical limitations include dependency on sample quality, ice thickness, and initial manual screening for motion correction and particle picking.
