Модель крупного животного для оценки эффективности генной терапии при ишемическом сердце

Генная терапия миокарда при ишемической болезни сердца имеет большие перспективы для будущих терапевтических средств. Здесь мы представляем модель на больших животных для оценки эффективности генной терапии в ишемизированном сердце.

Методы и методы визуализации, используемые в этом протоколе, представляют собой превосходное представление о безопасности и эффективности генной терапии при ишемическом сердце перед переходом к клиническим испытаниям. Основными преимуществами этого метода являются низкая инвазивность модели ишемии, а также точное нацеливание генной терапии на гипокинетические, но все еще жизнеспособные области сердца. Начните с выполнения трансторакальной эхокардиографии перед операцией по ишемии, переносом генов и эвтаназией, чтобы оценить любую обнаруживаемую перикардиальную жидкость и определить деформацию миокарда.

Поместите датчик в третье или четвертое межреберье под мышкой свиньи маркером, указывающим на грудину свиньи, чтобы получить доступ к парастернальной короткой оси на уровне митрального клапана, папиллярной мышцы и апикального уровня. Затем нажмите «Получить», чтобы сохранить клип. Для выполнения коронарографии непосредственно перед операцией по ишемии используют катетер 6-F под рентгеноскопическим контролем с йодным контрастным веществом для визуализации правой коронарной артерии, левой восходящей коронарной артерии и левой передней нисходящей артерии.

Для киновизуализации в автоинъекторе установите продолжительность болюса в три секунды и общий объем на 21 миллилитр, а затем нажмите одинарно, и да, чтобы ввести контрастное вещество йода в левый желудочек через катетер косички 5-F. Выполните киновизуализацию животного в состоянии покоя, а затем введите добутамин внутривенно и увеличивая дозы для индукции стресса. После достижения целевой частоты сердечных сокращений в 160 ударов в минуту выполняется киновизуализация и удаляется катетер косички.

Чтобы рассчитать фракцию выброса, откройте измерительное программное обеспечение, выберите желудочковый анализ рассматриваемого изображения. Прокрутите изображение, чтобы выбрать таймфрейм, один в диастоле и один в систоле, а затем выберите инструмент для рисования контуров желудочков каждого таймфрейма. Чтобы вызвать хроническую ишемию миокарда, за 14 дней до переноса генов поместите катушку в левую коронарную артерию и перенесите стент с бутылочным горлышком на левую коронарную артерию и поместите стент дистально к первой диагонали.

Надуйте стент до номинального давления в артерии, используя индефлятор с отношением стента к просвету 1,3 для закрепления узкого места на месте. Еще через 15 секунд сдуйте стент, вытяните оборудование из артерии и обеспечьте правильное размещение стента с узким горлышком с помощью ангиографии. После ангиографии и функциональных измерений под рентгеноскопическим контролем введите картирующий катетер в левый желудочек через оболочку бедренной кости для электроанатомического картирования и соберите не менее 100 точек из левого желудочка и нажмите «Принять», чтобы одобрить точку.

В итоговой карте для жизнеспособности в качестве критерия используйте униполярное напряжение свыше пяти милливольт. А при гипокинезии выбирайте локальное линейное укорочение как можно ниже, по крайней мере, до 12%, но желательно ниже 6%После эвтаназии животное извлеките сердце из грудной полости. После того, как собранное сердце будет промыто, поместите иглу 18-го калибра над аортальным клапаном и присоедините иглу к перфузионному насосу.

Перфузируйте сердце 750 миллилитрами 1%-ного параформальдегида. Используйте острый нож, чтобы разрезать сердце на ломтики толщиной в один сантиметр и собрать образцы из области переноса генов в 4% параформальдегид и жидкий азот. Храните образцы для окрашивания в 4% параформальдегиде в течение 48 часов при четырех градусах Цельсия.

Эффективность генной терапии анализировали путем измерения окружной деформации, фракции выброса и перфузии миокарда с помощью ПЭТ-сканирования 15O-воды. Образцы тканей могут быть собраны непосредственно из области переноса генов путем сравнения сердца с электроанатомической картой. Экспрессию трансгена и терапевтический ангиогенез оценивали с помощью иммуногистологического анализа путем анализа количества положительных клеток после окрашивания бета-галактозидазой и анализа капиллярной области миокарда после окрашивания молекулой адгезии тромбоцитов/эндотелиальных клеток-1.

Важно подтвердить размещение стента с узким горлышком с помощью ангиограммы и сбора образца из области переноса генов, что может быть подтверждено путем сравнения сердца с электроанатомической картой. В целом, крайне важно сделать все измерения наиболее воспроизводимым способом.