Анализ поглощения внеклеточных везикул с помощью конфокального микроскопического анализа изображений

Этот протокол обеспечивает надежную методологию анализа электромобилей на клеточном уровне и практический подход к эффективному поглощению электромобилей и анализу отслеживания электромобилей. Этот метод маркировки ЭЛЕКТРОМОБИЛей исключает совместное осаждение электромобилей и красителя, тем самым усиливая сигналы EV. Поглощение электромобилей измеряется объемным анализом, чтобы отличить интернализованные электромобили от поверхностных электромобилей.

Электромобили являются активным грузом, таким образом, их поглощение позволяет переносить биохимические молекулы. Для исследований по доставке лекарств на основе EV и терапии рака этот метод может быть инструментом оценки. Поглощение электромобилей играет роль в межклеточной коммуникации и исследуется в различных областях исследований, таких как биология рака, неврология и доставка лекарств.

Этот протокол потенциально облегчает эффективный анализ поглощения EV. Для выделения внеклеточных везикул, или EV, вводят один миллилитр предварительно обработанной клеточной культуральной среды в камеру образца микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации. Для работы устройства вращайте устройство в настольной прядильной машине со скоростью вращения 3000 об/мин в течение 10 минут.

После прядения удалите жидкость из камеры отходов путем пипетки или аспирации, затем повторите эту процедуру дважды для обработки дополнительных двух миллилитров клеточной культуральной среды. Затем, чтобы промыть изолированные электромобили, введите один миллилитр PBS в камеру для образцов и вращайте устройство в настольной прядильной машине. Для иммунофлуоресцентной маркировки EV вводят один микрограмм на миллилитр EV-специфического антитела в элюционное отверстие устройства, содержащее 100 микролитров изолированных EV.

Затем инкубируют в течение одного часа в темноте на пластинчатом шейкере, чтобы обеспечить равномерное распределение антитела по образцу. Далее прикрепите клейкую ленту к отверстию для элюирования. Введите один миллилитр PBS в камеру для отбора проб, чтобы вымыть остаточные антитела, затем вращайте устройство до тех пор, пока камера для отбора проб не опустеет.

Повторите промывку, введя еще один миллилитр PBS в камеру для отбора проб и вращая устройство, как показано ранее. После удаления остаточной жидкости из камеры пипетка флуоресцентно меченых электромобилей из мембранной камеры в янтарную трубку или микротрубку. Защитите трубку от света до использования.

Посейте четыре раза от 10 до четвертой ячейки PC3 в 35-миллилитровую чашку с одной миллилитровой средой. Позвольте клеткам прилипнуть в течение ночи в оптимальных условиях клеточной культуры. На следующий день дважды промыть прилипшие клетки экзосомной средой.

После разбавления флуоресцентно меченых EV до соответствующей концентрации с использованием сред, обедненных экзосомами, добавляют разбавленные EV к прилипшим клеткам-мишеням и инкубируют в течение желаемого экспериментального времени. После удаления неинтернализованных EV путем трижды промывки клеток средой, свободной от экзосом, маркируют цитоплазму прилипших клеток одним микрограммом на миллилитр CMTMR и инкубируют в оптимальных условиях клеточной культуры. Для визуализации живых клеток поместите подготовленные клетки в инкубатор на сцене.

После установки параметров визуализации на основе контрольных образцов определите глубину клеток-мишеней и диапазон размеров укладки в направлении Z для получения 3D-конфокальных изображений, затем установите получение изображения на несколько Z-образных изображений как клеточного красителя, так и EV-специфического красителя одновременно. Для обработки изображений используйте программное обеспечение для автоматической обработки изображений. Чтобы создать виртуальные поверхности ячеек, нажмите кнопку Добавить новые поверхности.

Чтобы настроить виртуальные поверхности ячеек, нажмите кнопку Добавить и выберите Качество в качестве типа фильтра. Пороговое значение соответствующего нижнего предела путем визуального осмотра, установите максимальное значение для верхнего предела и нажмите кнопку Готово Далее, чтобы построить виртуальные точки электромобилей, нажмите кнопку Добавить новые пятна. В разделе Параметры алгоритма выберите Различные размеры пятна и Расчет кратчайшего расстояния, затем нажмите кнопку Далее и выберите Канал 1 Alexa Fluor 488 в качестве исходного канала.

Введите соответствующее значение для предполагаемого диаметра XY в разделе Обнаружение пятен и нажмите кнопку Далее. Чтобы настроить виртуальные точки EV, нажмите кнопку Добавить и выберите Качество в качестве типа фильтра. Установите нижнее пороговое значение с помощью визуального осмотра и нажмите кнопку Далее Для типа областей пятна выберите Абсолютная интенсивность, затем нажмите кнопку Далее.

Чтобы установить пороговое значение для области точек EV, введите соответствующее значение для поля Region Threshold при визуальном осмотре. Выберите Диаметр из в разделе Объем области и нажмите кнопку Готово. Чтобы разделить сгруппированные пятна внутри построенной поверхности, нажмите на Точки сборки и перейдите в Фильтры.

Затем нажмите кнопку Добавить и выберите Кратчайшее расстояние до поверхностей, Surfaces Surface 1 в качестве типа фильтра. После установки нижнего порогового значения для нижнего предела и соответствующего значения для верхнего предела нажмите кнопку Дублировать раздел, чтобы перейти на новую кнопку Места. Для автоматического подсчета электромобилей внутри ячеек щелкните выбор Построенные места 1, перейдите в раздел Статистика и экспортируйте значение из общего числа мест.

Чтобы получить количество ячеек, щелкните Встроенные поверхности 1, затем перейдите в раздел Статистика и экспортируйте значение Общее количество поверхностей из общего. Наконец, перейдите на вкладку Подробные сведения в разделе Статистика, чтобы экспортировать том. Ev, выделенные из среды клеточной культуры PC3 с использованием микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации, были помечены фтор-4-конъюгированным EV-специфическим антителом и визуализированы с использованием 3D-конфокальной микроскопии.

Интернализованные электромобили были визуализированы как пункта, и индивидуальная EV.Post обработки этих изображений позволяет визуализировать и количественно оценить интернализацию EV в клетки. Результаты анализа поглощения EV показывают, что уровень поглощения EV зависит от продолжительности инкубационного периода. Количество интернализованных EV может быть нормализовано до объема ячейки реципиента для определения фактической скорости поглощения EV для указанной ячейки.

Эта процедура позволяет систематически исключать неинтернализованные электромобили для точного измерения количества интернализованных электромобилей. Распределение размеров интернализованных точек EV показано здесь. Таким образом, ключевыми шагами являются использование микрофлюидного устройства для маркировки электромобилей, минимизация фоновой флуоресценции при визуализации флуоресцентных электромобилей, а затем анализ после визуализации для определения интернализованных и поверхностных электромобилей.

Таким образом, внутриклеточное отслеживание EV может быть выполнено в режиме реального времени на 3D-плоскости, и, кроме того, может быть достигнут анализ трафика EV на пространственных / временных разрешениях и колокализация EV с субклеточными органеллами. Таким образом, мы считаем, что этот метод обеспечивает более простой и эффективный способ исследования EV во внутри- и внеклеточных матрицах для исследователей в области сотовой связи для электромобилей.