Получение многофункциональных микрокапсул на основе шелка, загруженных ДНК-плазмидами, кодирующими РНК-аптамеры и рибопереключатели

Значение этого протокола заключается в том, что он предоставляет средства для поддержания работоспособности ДНК-кодированных сенсоров путем иммобилизации плазмидных матриц ДНК в полупроницаемые биосовместимые микрокапсулы. Предложенная методика иммобилизации ДНК является универсальной. Это позволяет изготавливать многофункциональные биосенсоры с различными механизмами активации in vitro.

Мы предполагаем, что эти микрокапсулы в сочетании с соответствующими чувствительными элементами могут быть использованы для изучения различных биологических процессов, включая высвобождение сигнальных молекул в различных средах, таких как биопленки и органы. Этот метод может дать представление о биологических системах на микроуровне, в частности, о том, как иммобилизация ДНК и молекулярная скученность могут повлиять на кинетику и механизм активации генов. Начните с осаждения первичного слоя полиэтиленимина на микрочастицы жертвенного диоксида кремния, или SiO2, добавив один миллилитр раствора полиэтиленимина к 300 микролитрам микрочастиц в двухмиллилитровой микроцентрифужной пробирке.

Перемешивайте смесь на термомиксере со скоростью 800 оборотов в минуту при температуре окружающей среды. Соберите микрочастицы центрифугированием в дозе 0,2 г в течение одной минуты при комнатной температуре, и осторожно удалите надосадочную жидкость. Через 15 минут четыре раза промыть микрочастицы одним миллилитром деионизированной воды, не содержащей ДНКазы и РНКазы, центрифугированием в дозе 0,2 г в течение одной минуты при комнатной температуре, отбрасывая надосадочную жидкость после каждого центрифугирования.

Затем отрегулируйте концентрацию ДНК-плазмид от 50 до 200 нанограмм на микролитр с помощью дистиллированной воды, не содержащей ДНКазы и РНКазы, и используйте один миллилитр приготовленных растворов для осаждения ДНК на микрочастицах, запраянных полиэтиленимином. Осторожно перемешайте смесь микрочастиц на термомиксере при температуре 4 градуса Цельсия и 800 об/мин в течение 15 минут, а затем соберите микрочастицы центрифугированием при плотности 0,2 г в течение одной минуты. Пробирки для плазмид ДНК, кодирующих рибопереключатель теофиллина, связанного с GFPa1, в сочетании с GFPa1 обозначены как ThyRS-GFPa1, а плазмиды ДНК, кодирующие аптамер брокколи, обозначены как BrocApt.

Осторожно удалите надосадочную жидкость и четыре раза промойте микрочастицы одним миллилитром дистиллированной воды, не содержащей ДНКазы и РНКазы, как было продемонстрировано ранее, выбрасывая надосадочную жидкость после каждого центрифугирования. Чтобы нанести слой фиброина шелка, добавьте один миллилитр восстановленного водного раствора фиброина шелка к микрочастицам, поглощенным ДНК, и осторожно перемешайте смесь на термомиксере при 750 об/мин в течение 15 минут при температуре 10 градусов Цельсия. Соберите микрочастицы центрифугированием, а затем промойте их один раз одним миллилитром дистиллированной воды, не содержащей ДНКазы и РНКазы, как объяснялось ранее.

Повторите центрифугирование и выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте 0,5 миллилитра дистиллированной воды ДНКазы и РНКазы, и перемешайте микрочастицы путем вортексирования. Затем обработайте микрочастицы 0,5 миллилитрами 100% метанола при температуре 10 градусов Цельсия в течение пяти минут на термомиксере.

После сбора микрочастиц методом центрифугирования обрабатывайте частицы 100% метанолом на термомиксере со скоростью 750 оборотов в минуту в течение 10 минут при температуре 10 градусов Цельсия для формирования бета-листа. Центрифугируйте смесь при плотности 0,2 г в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия для сбора микрочастиц перед двукратной промывкой частиц одним миллилитром дистиллированной воды, не содержащей ДНКазы и РНКазы, как было показано ранее. Растворите ядра микрочастиц SiO2, добавив 8% раствор фтористоводородной кислоты к гранулированным микрочастицам оболочки ядра.

Перенесите растворенные частицы в аппараты для диализа и обработайте их против деионизированной воды в стакане. Затем с помощью пипетки объемом в один миллилитр соберите суспензию шелковых микрокапсул из диализных аппаратов в новые двухмиллилитровые микроцентрифужные пробирки. Перенесите 100 микролитров образца микрокапсулы в одну лунку с восьмикамерными стеклянными предметными стеклами и дайте капсулам отстояться в течение 20-30 минут перед визуализацией с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа или CLSM.

Пипеткой внесите по 100 микролитров суспензии капсул в каждую лунку камерного предметного стекла. В каждую лунку последовательно добавляйте по 300 микролитров раствора флуорофора различной молекулярной массы от самой низкой до самой высокой. Перемешайте смесь пипеткой вверх и вниз и дайте смеси инкубироваться в течение одного часа при комнатной температуре, пока диффузия растворов флуорофоров не достигнет равновесия.

Затем перенесите предметное стекло на CLSM, чтобы получить изображение каждой скважины с помощью 100-кратного объектива для погружения в нефть с длиной волны возбуждения 488 нанометров. Определите интересующую область, регулируя фокальную плоскость, и сосредоточьтесь на капсулах, которые появляются в виде кругов наибольшего диаметра. Проведите реакцию транскрипции/трансляции in vitro путем последовательного добавления бесклеточных компонентов в образец микрокапсул и инкубации пробирки при температуре 30 градусов Цельсия в течение четырех часов.

Проверьте флуоресценцию на планшетном считывателе с использованием длины волны возбуждения на 488 нанометрах и излучения для фильтра GFP/FITC на расстоянии около 510 нанометров. Наконец, получите изображение шелковых микрокапсул в системе CLSM с помощью лазеров на 488 и 561 нанометрах. В ходе исследования были получены прочные микрокапсулы из фиброина шелка с однородным размером около 4,5 микрометров и толщиной оболочки около 500 нанометров.

Проницаемость оболочек капсул из полого шелкового фиброина анализировали методом отсечения по молекулярной массе. Увеличение концентрации первичного слоя полиэтиленимина приводит к повышению коллоидной стабильности микрокапсул с более проницаемыми оболочками, в то время как устранение первичного слоя вызывает агрегацию капсул с менее проницаемыми мембранами оболочек. Кинетика экспрессии GFPa1 во время активации ThyRS показала более высокую активацию гена GFPa1 из плазмид ДНК, загруженных в шелковые микрокапсулы, чем у контрольной неинкапсулированной ДНК.

В репрезентативном анализе представлены CLSM-изображения капсул с фиброином шелка, загруженных 32 копиями ДНК на капсулу до и после инкубации в системе трансляции in vitro. Профили поперечного сечения капсул с фиброином шелка продемонстрировали экспрессию GFPa1. Кинетика транскрипции 20 слоистых шелковых микрокапсул, загруженных 30 копиями ДНК на капсулу, сравнивалась с контрольной неинкапсулированной ДНК.

Более высокий выходной сигнал от шелковых микрокапсул по сравнению с неинкапсулированными образцами ДНК эквивалентных концентраций подтвердил эффективность шелковых микрокапсул. Следуя этому протоколу, можно применять несколько методов микроскопии с высоким разрешением для визуализации запутывания ДНК в иммобилизованном состоянии и процесса активации разъединенных генов in vitro. Этот метод может быть применен для ответа на динамику молекулярного уровня в минимальных искусственных клетках.

В частности, в сочетании с соответствующими генными элементами микрокапсулы могут быть использованы для изучения межклеточной коммуникации.