Измерения прямой силы субклеточной механики в конфайнменте с помощью оптического пинцета

Этот протокол препарирует отдельные механические свойства клеточного ядра, которые делают его механическим датчиком поляризации, дифференцировки и миграции клеток. Основным преимуществом этой методики является то, что она может измерять механические свойства и прикладывать силы к субклеточным компартментам без внешнего возмущения мембраны или кортикального цитоскелета. Протокол может быть легко адаптирован для манипулирования шариками внутри других клеток другого организма с целью изучения ядерной механики в различных клеточных линиях или животных моделях.

Выравнивание датчика прямой силы имеет решающее значение для захвата всего света, создающего и покидающего оптические ловушки. Это обеспечит точные измерения светового импульса в вязкоупругой среде ячейки. Начните одноклеточную подготовку, поместив эмбрионы сферической стадии через четыре часа после оплодотворения в стеклянную посуду, содержащую среду Е3, с помощью пластиковой пипетки Пастера.

Затем выберите эмбрионы, которые являются положительными для шариков и экспрессируйте флуоресцентный белок в случае инъекции мРНК. Используйте щипцы, чтобы вручную декурионировать эмбрионы и перенести примерно от 10 до 15 декурионированных эмбрионов в 1,5-миллилитровый реакционный контейнер с помощью стеклянной пипетки Пастера. Извлеките среду E3 из пробирки и добавьте 500 микролитров предварительно нагретой питательной среды, независимой от диоксида углерода.

Осторожно встряхните трубку, избегая образования пузырьков, и убедитесь, что содержимое трубки становится мутным, поскольку клетки диссоциируют без больших кусков, видимых глазом. Затем центрифугируют трубку в 200 раз G в течение трех минут. После центрифугирования удалите супернатант и соберите гранулу, чтобы продолжить окрашивание клеток.

Чтобы пометить ядро, повторно суспендируйте клетки, добавив в трубку 500 микролитров свежеприготовленного раствора для окрашивания красителя ДНК Hoechst. Инкубируйте окрашенные клетки в течение семи минут в темноте. Затем центрифугируют клетки, как описано ранее, и повторно суспендируют гранулу либо в 50 микролитрах DMEM для образцов в суспензии, либо в 20 микролитрах DMEM для клеток в конфайнменте.

Для приготовления оптических траппингов или от-камеры для экспериментов с ячейками в суспензии вырежьте кусок двусторонней скотча с квадратным отверстием примерно 10 мм на 10 миллиметров в центре. Снимите один из защитных слоев ленты и поместите непокрытую сторону ленты в центр стеклянной нижней тарелки No 1,5 H. Осторожно прижмите ленту, чтобы вся поверхность ленты прилипла к стеклу, избегая при этом пузырьков воздуха и отслаивания оставшегося защитного слоя ленты.

Инкубируйте поверхность со 100 микролитрами конканавалина А по 0,5 миллиграмма на миллилитр в течение 30 минут. Затем удалите каплю Конканавалина А и промойте поверхность DMEM. Добавьте 30 микролитров раствора, содержащего клетки, на поверхность полости.

Затем очень осторожно закройте камеру с помощью покровного стекла размером 22 на 22 миллиметра. При необходимости используйте скальпель или щипцы. Затем приступайте к запуску оптического пинцета, включив лазер на значительно высокой мощности не менее чем за 30 минут до начала эксперимента, чтобы оптимизировать стабильность выходной мощности.

Когда это будет сделано, включите электронный модуль оптических микроманипуляторов и единиц измерения силы. Перед выравниванием датчика оптической силы поместите каплю воды на объектив погружения в воду 60X 1.2 и поместите камеру, содержащую ячейки, на сцену. Сосредоточьтесь на нижней поверхности камеры, где будут размещены образцы клеток.

После добавления капли погружного масла поверх стеклянного слайда крышки, покрывающего образец, опустите собирающую линзу блока датчика силы до тех пор, пока она не соприкоснется с каплей масла. Следуя стандартной процедуре выравнивания оптического датчика силы, посмотрите на изображение плоскости образца на вспомогательной камере, которая будет использоваться для позиционирования ОТ, затем опустите датчик оптической силы до тех пор, пока его полевая остановка не появится сопряженной с плоскостью образца. Чтобы проверить наличие пузырьков воздуха с помощью объектива Бертрана, наблюдайте за траекторией изображения через вспомогательную камеру.

Если видны какие-либо пузырьки грязи или воздуха, очистите линзу и камеру безпылевой тканью хрусталика, прежде чем повторить процедуру, как описано, добавив больше погружного масла. С помощью боковых винтов, размещенных на держателе оптического датчика силы, центрируйте поле остановки в поле зрения. Для точности откройте поле остановки почти до того, чтобы занять поле зрения, видимое на вспомогательной камере.

После помещения образца в микроскоп и выравнивания датчика оптической силы используйте вращающуюся полуволновую пластину, чтобы установить начальную мощность ловушки на 200 милливатт, если жесткость исследуемого ядра или исследуемой межклеточной структуры неизвестна. После этого используйте программный контроллер ступени микроскопа для поиска ячейки с одной или двумя шариками через передаваемую микроскопию Brightfield. В числовом листе запишите смещение и время каждого последующего шага траектории.

В качестве альтернативы можно загрузить таблицу S1 из дополнительного материала. Для эксперимента со стрессом/релаксацией запрограммируйте трапециевидные нагрузки, которые будут применяться. В программном обеспечении OT активируйте оптические ловушки.

Для захвата микросферы установите плоскости изображения немного выше бусины с помощью программного контроллера ступени микроскопа. Нажмите на полистирольную микрогранулу в откалиброванном вспомогательном окне изображения камеры. Успешное удержание шарика оптической ловушкой сильно уменьшит движение шарика.

Нажмите и перетащите шарик через цитоплазму и поместите его на расстояние примерно двух микрон от ядерной оболочки. Убедитесь, что траектория установлена таким образом, чтобы углубление шарика было перпендикулярно ядерной мембране. Когда настройка будет готова, перейдите к программному обеспечению для обработки изображений и нажмите кнопку получения, чтобы начать получение изображения.

Откройте окно принудительного чтения в режиме реального времени, нажмите на данные и сохраните в окне принудительного чтения в режиме реального времени, чтобы сохранить. Данные о положении пусковой ловушки и измерении силы. Инициируйте ранее загруженную траекторию, щелкнув правой кнопкой мыши по бусине и выбрав стартовую траекторию.

Подождите, пока траектория не будет завершена, и система стабилизируется, прежде чем закончить запись данных измерения силы ловушки. Остановите получение изображений и отобразите результаты в программном обеспечении для постобработки. В репрезентативном анализе отображается изолированная стволовая клетка-предшественник рыбки данио с одной микросферой, близкой к ядру.

Контролировалось распределение микросферы полистирола через пять часов после инъекции внутри эмбриона. Яркое и флуоресцентное изображение показывает, что шарики диспергированы по ткани эмбриона. Максимальная проекция конфокального флуоресцентного Z-стека и максимальная проекция подстека в той же области подтверждают, что большая доля глубоких ячеек содержала от одного до двух шариков.

Через 24 часа после оплодотворения шарики были распределены по всему телу эмбриона. Получены микрофотографии Суспензионных ячеек Брайтфилда на замкнутых клетках с одной или двумя введенными шариками. Кроме того, множественные флуоресцентные метки облегчили исследование различных аспектов клеток, таких как межядерная мембрана, плазматическая мембрана, ДНК и трансгенная линия.

Репрезентативные снимки описывали меченые Хёхстом ядра за пять секунд до/во время и через пять секунд после отступа с оптически захваченной микросферой. Изучены профили интенсивности вдоль сегмента отступа для трех различных рамок и траекторий дистальных и проксимальных границ ядра в ходе эксперимента по углублению взвешенных и замкнутых клеток. Была измерена захваченная траектория и сила, испытываемая оптически захваченной микросферой во время повторного эксперимента по ядерному углублению.

Механика ядра в камерах в суспензии и под удержанием подтвердила, что удержание привело к расширению прогнозируемой площади и незначительному изменению ядерной жесткости. Если шарики вводят в эмбрион одной клеточной стадии, они, скорее всего, равномерно распределятся на более поздних стадиях. Помните, что бусина должна быть стабильно поймана в ловушку.

Если шарик выходит из оптической ловушки, переопределите траекторию или увеличьте мощность лазера. Эти эксперименты могут быть легко выполнены на нескольких микрошариках внутри одной клетки и расширены до активных микрореологических измерений.