Флуоресцентно-активированная клеточная сортировка-радиолигандная обработанная ткань (FACS-RTT) для определения клеточного происхождения радиоактивного сигнала

Этот протокол дополняет визуализацию in vivo. Он позволяет количественно определять тип ячейки и клеточный уровень радиоиндикаторов, что отличается от шкалы, полученной in vivo. Основным преимуществом этой методики является ее чувствительность и клеточное разрешение, обеспечиваемое использованием радиолигандов и сортировкой клеток.

Включите камеру и загрузите операционное программное обеспечение. Нажмите на кнопку Home XYZ stage, чтобы выполнить самонаведение. Настройте эксперимент, состоящий из одного 10-минутного сканирования.

Установите для режима Step значение fine, а для режима Acquisition — Listmode для записи всего спектра излучения. Установите кровать и убедитесь, что система подогрева, датчик дыхания и анестезия являются функциональными и безопасными. Затем поместите фантом там, где будет расположена голова животного.

Установите область сканирования, переместив курсоры для трех измерений с помощью трех изображений в нижней части экрана. Убедитесь, что объем сканирования фантома и животного одинаков. Запустите фантомное сканирование для последующей калибровки с ранее установленными параметрами.

Обеспечить работу в соответствующей среде, разрешенной для экспериментов, связанных с радиоактивностью. Инкубировать 100 мкг предшественника трибутилина в 100 микролитрах уксусной кислоты с йодидом натрия и пятью микролитрами 37%-ной парацетиновой кислоты при 70 градусах Цельсия в течение 20 минут в термоциклере, расположенном в бардачке. Разбавляют реакцию, используя 50% ацетонитрила в воде до объема 500 микролитров.

Введите 500 микролитров разбавленной реакции в колонну обратной фазы. Изолируют КЛИНД с линейно-градиентным ВЭЖХ, работающим от 5 до 95% ACN в семимиллимолярной фосфорной кислоте в течение 10 минут. Разбавьте изолят в воде для достижения конечного объема в 10 миллилитров, а затем введите разбавленную реакцию в концентрационную колонну.

Элюируйте КЛИНД из колонны 300 микролитрами абсолютного этанола, а затем испаряйте этанол, инкубируя его в вакуумной центрифуге при комнатной температуре в течение 40 минут. Разбавьте остаток, содержащий КЛИНД, в 300 микролитрах физиологического раствора для создания запасного раствора. После измерения его радиоактивности разводят исходный раствор в физиологическом растворе для получения раствора 0,037 мегабеккереля в 500 микролитрах.

Установите калибровочные кривые с холодными эталонными соединениями и разрешите уравнение линейной регрессии: Y, равное AX плюс B, чтобы получить коэффициенты A и B. X представляет массу холодного соединения, а Y представляет площадь под кривыми. Проверьте площадь под кривой радиолиганда, измерив ультрафиолетовое поглощение на 450 нанометров на основе калибровочной кривой и площадь под кривой радиолиганда.

Оцените массу и измерьте активность радиолиганда. Убедитесь, что удельная активность превышает 1000 гигабеккерелей на микромоль. Нажмите кнопку Обновить изображение, чтобы обновить положение животного.

Установите область сканирования, переместив курсоры с помощью трех изображений в нижней части экрана для трех измерений. Настройте эксперимент на 60-минутное сканирование, составляющее 60 кадров одной минуты. Повторно используйте все остальные параметры, настроенные изначально.

Введите 500 микролитров радиоактивного радиоиндикатора, а затем промывайте трубку 300 микролитрами стерильного 0,9% хлорида натрия. Одновременно нажмите Начать сбор, чтобы начать сканирование. Откройте программное обеспечение для восстановления сканирования, а затем откройте набор данных, выполнив поиск файла параметров имени файла, созданного в папке сканирования.

Выберите интересующий вас изотоп. Обратите внимание, что параметр режима списка позволяет выбрать несколько изотопов на этом шаге. Задайте различные параметры реконструкции, такие как размер вокселя, количество подмножеств и итерации, как описано в рукописи.

Выберите выходной формат NIFTI, а затем выберите Начать реконструкцию SPECT. Используйте плоский металлический шпатель и лезвие бритвы для рассечения областей, представляющих интерес для мозга. Поместите ткани в двухмиллилитровую центрифужную трубку и взвесьте полученную ткань.

Поместите образцы в двухмиллилитровую центрифужную трубку с одним миллилитром HBSS без кальция и магния, а затем центрифугу в 300 раз G в течение двух минут при комнатной температуре и удалите супернатант, не нарушая гранулу. Добавьте 1 900 микролитров фермента, смешайте один и инкубируйте его в течение 15 минут при 37 градусах Цельсия, перемешивая трубки путем инверсии каждые пять минут. Добавьте 30 микролитров фермента, смешайте два.

Осторожно перемешайте пипеткой объемом 1000 микролитров вперед и назад 30 раз. Затем инкубируйте смесь в течение 15 минут при 37 градусах Цельсия, перемешивая трубки путем инверсии каждые пять минут. Осторожно перемешайте туда и обратно с 200-микролитровой пипеткой, а затем 10-микролитровой пипеткой, прежде чем инкубировать смесь в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия, чтобы диссоциировать ткани.

Отфильтруйте клетки с помощью 70-микрометрового клеточного сетчатого фильтра и добавьте 10 миллилитров HBSS без кальция и магния. Центрифугу в 300 раз G в течение 10 минут при комнатной температуре и удалите супернатант, не нарушая гранулу. Для истощения миелина повторно суспендируйте гранулу с 400 микролитрами буфера удаления миелина, а затем добавьте 100 микролитров шариков для удаления миелина перед инкубацией в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.

Добавьте пять миллилитров буфера для удаления миелина и центрифугу 300 раз G в течение 10 минут при комнатной температуре. Добавьте 500 микролитров буфера для удаления миелина и поместите взвешенные гранулы в столб магнитного поля. Промыть столбик одним миллилитром буфера для удаления миелина четыре раза.

Центрифугировать в 300 раз G в течение двух минут при комнатной температуре и удалить супернатант, не нарушая гранулу. Вихрь ненадолго, чтобы диссоциировать клетки и добавить пять микролитров Fc Block CD32. Добавьте 100 микролитров смеси первичных интересующих антител и инкубируйте в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия.

Центрифугируйте в 350 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и удалите супернатант, не нарушая гранулу. Промокните трубки вверх ногами на мягкой бумаге. Вихрьте трубку ненадолго, затем добавьте 100 микролитров смеси вторичных антител и инкубируйте в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.

Добавьте один миллилитр буфера удаления миелина и повторите центрифугирование. Выбросьте супернатант и промойте трубки вверх ногами на мягкой бумаге. Повторно суспендируйте клетки в 250 микролитрах стерильного PBS и приступайте непосредственно к сортировке клеток.

Сканирование in vivo ОФЭКТ крыс дикого типа показало более высокое связывание КЛИНД в месте инъекции липополисахарида, чем в контратеральной области мозга. Образцы ex vivo, которые подверглись флуоресцентной активированной клеточной сортировке ткани, обработанной радиолигандом, или FACS-RTT, выявили наличие большего числа сайтов связывания CLINDE только в микроглии, показывая, что клеточное происхождение сигнала CLINDE в ипсилатеральной стороне мозга было микроглией. Увеличение транслокаторного белка, или связывания TSPO, через 12 месяцев у крыс TgF344-AD было ограничено астроцитами.

У 24-месячных крыс наблюдалось увеличение связывания TSPO из-за как астроцитарных, так и микроглиальных изменений. У более старых крыс TgF344-AD стриатальные астроциты демонстрировали снижение плотности 5HT2AR по сравнению с диким типом. Кортикальная сверхэкспрессия TSPO наблюдалась как в астроцитах, так и в микроглии субъектов AD по сравнению с контрольной группой, соответствующей возрасту, когда FACS-RTT проводился на посмертных образцах AD человека.

При работе с радиоактивностью следуйте инструкциям по радиозащите и носите соответствующие средства индивидуальной защиты. Затем, после процедуры, обязательно обеззаражьте рабочую среду. Количественная оценка белка и анализ экспрессии генов могут быть легко выполнены после этой процедуры на изолированных клеточных популяциях.