Количественная оценка уровней морфологического изменения и дегенерации дофаминергических нейронов у Caenorhabditis elegans
20 ноября 2021 г.
В этой статье мы показано, как использовать семиточечную систему подсчета баллов для последовательной количественной оценки изменений морфологии дендритов дофаминергических нейронов у C. elegans. Эта система предназначена для анализа дофаминергических нейродегенеративных анализов с использованием генетических, химических и возрастных моделей нейродегенеративных расстройств.
В этом видео мы покажем, как использовать семиточечную систему подсчета баллов для количественной оценки изменений морфологии дендритов дофаминергических нейронов в C.elegans. В настоящее время существуют большие различия в аналитических методах количественной оценки нейродегенерации у червей. Кроме того, некоторые существующие навыки сосредоточены только на клеточных телах и не чувствительны к определенным типам и уровням повреждения.
Цель внедрения этой системы оценки состоит в том, чтобы обеспечить возможность захвата всеобъемлющей картины нейродегенерации на всех уровнях повреждения и обеспечить универсальную систему для поддержки согласованности в исследованиях дофаминергической нейродегенерации C.elegans. Здесь мы продемонстрируем, как визуазировать нейроны в условиях флуоресценции, присваивать оценки дендритам этих нейронов и просматривать, как отображать и интерпретировать результаты. Для каждой экспериментальной группы пипетка или кирка от 20 до 30 червей на платформе визуализации, совместимой с микроскопом визуализации.
Наиболее распространенные платформы включают 2% агарозные прокладки, установленные на стеклянных слайдах с крышкой, и 96-луночные пластины, содержащие объемы скважины на 100 микролитров жидкой среды или менее. Позвольте червям полностью парализоваться. Это может занять несколько минут.
Загрузите подготовленную платформу визуализации в микроскоп визуализации, способный захватывать z-стек. Найдите область головы червя сначала в ярком поле, а затем под одноцветной флуоресценцией GFP с помощью микроскопа визуализации. Червь показан здесь в 400-кратном увеличении.
Прокрутите фокус, чтобы найти верхнюю и нижнюю границы, где дендриты чисты. Установите их в качестве верхней и нижней границ для захвата изображений z-stack. Выберите желаемый шаг.
Здесь мы используем один микрометр. Щелкните, чтобы захватить изображения z-стека в флуоресцентном канале GFP. Для каждого z-стека откройте файл изображения с помощью программного обеспечения микроскопа или внешнего программного обеспечения для анализа изображений.
Загрузите стек в программное обеспечение и сожмите стек в одно сглаженное изображение. Выравнивание изображений между группами обработки и внутри нее вручную или с помощью программного обеспечения с автоматическим подмотом. Работайте с одним изображением нейрона за раз.
Выберите один из четырех дендритов CEP для оценки засорения, разрывов и неровностей, включая изгибы, изгибы и кривые. Оценка слева направо, когда нос находится в верхней части изображения, рекомендуется для обеспечения повторяемости при подсчете очков. Используя эти рекомендации, присвойте каждому дендриту одно значение балла.
Присвоить нулевой балл для дендритов без видимых повреждений, балл один для дендритов с неровностями, но без блобинга или поломки, счет два для дендритов с менее чем пятью блебами, балл три для от пяти до 10 блебов, счет четыре для более чем 10 блобов и / или поломки, удаляющие до 25% дендрита, пять баллов за удаление от 25 до 75% дендрита при поломке и шесть баллов, если отсутствует более 75% дендрита. Если в пределах одного дендрита выполняется несколько критериев, рассмотрите критерии, соответствующие наивысшему баллу. Эти репрезентативные изображения, найденные на рисунке 1 статьи, связанной с этим видео, могут быть использованы в качестве ссылки.
Чтобы продемонстрировать оценку, мы рассмотрим присвоение баллов нескольким примерам изображений нейронов. Начните с верхнего самого дендрита, здесь нет видимых блебов, разрывов или неровностей. Присвойте нулевой балл.
Второй дендрит имеет около 14 блебов и не имеет видимых разрывов. Присвойте балл четырем. Третий дендрит не может быть виден в полном объеме из-за перекрытия с дендритом два и не может быть оценен.
Нижний самый дендррит имеет около 11 блебов и несколько разрывов. Присвойте балл пять. На этом изображении только три дендрита поддаются оценке, так как один дендрит не был полностью захвачен в z-стеке захвата.
На трех видимых дендритах нет блеббинга. Таким образом, это будет оценено сверху донизу как ноль, ноль, и из-за излома здесь, единица. Наконец, на этом изображении все четыре дендрита потеряны более чем на 75%.
Все дендриты здесь получают оценку шесть. Запишите все партитуры. В это время оценки могут быть необольченными.
Шаблон оценки, используемый здесь, можно найти в Дополнительных файлах. Разделите подсчет баллов нейродегенерации на общее количество дендритов, набранных в группе лечения. Представлены данные в виде доли дендритов в группе лечения по каждому баллу нейродегенерации.
Наша система оценки была использована для оценки нейродегенерации в личиночной стадии L4 BY200 C.elegans после воздействия ротенона. Данные отображаются здесь как с пропорциями общего числа дендритов при каждом значении балла для каждой экспериментальной группы. Мы считаем, что каждый дендрит, оцененный как n 1.
На этом рисунке можно оценить дозозависимую реакцию нейродегенерации на воздействие ротенона, и четко отобразится специфическая разбивка распределения баллов. Эти экспериментальные группы были статистически разными в соответствии с тестом Хи-квадрат на независимость, дополненным поправкой Бонферрони для нескольких сравнений. В этом видео мы продемонстрировали, как использовать семиточечную шкалу, разработанную в нашей лаборатории, для количественной оценки уровней морфологического изменения и дегенерации дофаминергических нейронов у C.elegans.
Использование метода подсчета баллов способствует последовательности в анализе и позволяет сравнивать исследования нейродегенерации у червей. Наша система оценки может быть использована для анализа данных, полученных из экспериментов C.elegans, в которые используются специфические для клеток флуоресцентные репортеры, такие как ген переносчика дофамина dat-1, которые позволяют визуализировать дофаминергические нейроны. Теперь, пожалуйста, найдите практический набор изображений с комментариями, которые можно использовать для обучения, калибровки и оценки согласованности оценок исследователей, новичков в этом методе, в дополнительном материале этой статьи.
Обзор
В данной статье демонстрируется применение семибалльной системы оценки для количественного анализа изменений морфологии дендритов дофаминергических нейронов C. elegans. Цель работы заключается в стандартизации анализа нейродегенерации в различных методах исследования для повышения согласованности данных при изучении нейродегенеративных заболеваний.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Нейродегенерация
- Морфологическая оценка
Теоретические основы
- Современные методы оценки нейродегенерации у C. elegans существенно различаются.
- Существующие методики зачастую фокусируются на телах клеток, а не на повреждениях дендритов.
- Необходима комплексная система оценки для получения более полной картины нейродегенеративных эффектов.
- Данная система позволяет определить степень тяжести повреждений на нескольких уровнях.
Цель исследования
- Создать универсальную систему оценки для анализа изменений дендритов в дофаминергических нейронах.
- Обеспечить согласованность оценок нейродегенерации в различных исследованиях на C. elegans.
- Позволить исследователям сравнивать результаты, полученные на различных генетических и химических моделях.
Используемые методы
- В исследовании используется имидж-микроскоп для получения z-стеков изображений нейронов.
- Основной биологической моделью является C. elegans, при этом особое внимание уделяется морфологии дофаминергических нейронов.
- Баллы варьируются от нуля до шести и соответствуют различным степеням повреждения дендритов.
- Методика включает точные этапы визуализации, захвата изображений и оценки дендритов для обеспечения согласованности результатов.
- Данные представлены в виде доли дендритов для каждого балла нейродегенерации.
Основные результаты
- Система оценки эффективно дифференцирует степени нейродегенеративных изменений в дофаминергических нейронах.
- Данные указывают на дозозависимый нейродегенеративный ответ при воздействии ротенона.
- Статистический анализ демонстрирует значимые различия между экспериментальными группами.
- В целом, данная система позволяет проводить четкую количественную оценку и сравнение результатов в разных исследованиях.
Выводы
- Данное исследование позволяет проводить более стандартизированный анализ нейродегенерации в моделях C. elegans.
- Метод оценки способствует единообразию и позволяет проводить более четкие сравнения в исследованиях.
- Работа вносит вклад в понимание механизмов нейрональной дегенерации, имеющих значение для нейродегенеративных заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Стандартизированная количественная оценка морфологии дофаминергических нейронов у C. elegans способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков в исследованиях нейродегенеративных заболеваний. Универсальная система оценки позволяет проводить воспроизводимый количественный анализ дегенерации дендритов, повышая прогностическую достоверность доклинических моделей. Это облегчает сравнение результатов различных исследований и приоритизацию портфеля программ по изучению болезни Паркинсона и сопутствующих нейродегенеративных процессов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественной оценки морфологических изменений на уровне дендритов дофаминергических нейронов.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет использования стандартизированной семибалльной шкалы, которая фиксирует степени нейродегенерации от легкой до тяжелой.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в выбранной мишени, предоставляя данные о дозозависимом ответе (например, эффекты воздействия ротенона) для валидации механизма действия.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные данные о морфологии дендритов, подходящие для стандартизации анализа и подготовки к высокопроизводительному скринингу с высоким содержанием данных.
- Практическая ценность: Обеспечивает масштабируемые и воспроизводимые рабочие процессы визуализации с использованием Z-стека флуоресцентных изображений и автоматизированного или ручного подсчета дендритов.
- Применимость анализа: Позволяет получать пропорциональные распределения баллов для статистического сравнения групп терапии с помощью критерия хи-квадрат с поправкой Бонферрони.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная ценность: Связывает модели дофаминергических нейронов C. elegans с путями нейродегенерации у человека через консервативные морфометрические конечные точки.
- Доклиническая значимость: Поддерживает принятие решений о продвижении с учетом рисков путем количественной оценки прогрессирования дегенерации в генетических и химических моделях.
- Механистическое снижение рисков: Разъясняет взаимосвязь между структурой и функцией, коррелируя повреждения дендритов (пузырьки, разрывы, перегибы) с функциональной потерей нейронов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего этапа поиска, обеспечивая идентификацию перспективных соединений посредством количественного фенотипирования нейродегенерации в моделях C. elegans.
- Поисковая биология: позволяет проверять гипотезы о нейропротекторных соединениях путем оценки целостности дендритов в нейронах, экспрессирующих dat-1::GFP.
- Скрининг: обеспечивает получение стандартизированных результатов, готовых для анализа, с помощью Z-стековой визуализации и подсчета дендритов для оценки библиотек соединений.
- Аналитика: предоставляет количественные показатели нейродегенерации (0–6), которые служат основой для статистического анализа и межлабораторной воспроизводимости.
- Трансляционные исследования: связывают морфологию нейритов червя с патологией дендритов млекопитающих, что позволяет проводить валидацию мишеней в соответствии с биомаркерами.
- Корпоративное повторное использование: создает масштабируемую и переносимую систему оценки для согласованного анализа нейродегенерации на различных платформах поиска на базе C. elegans.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность за счет фиксации всего спектра изменений дендритов: от образования блеббинга до их полной потери.
- Практическая ценность: Повышает стандартизацию и воспроизводимость благодаря универсальной системе оценки и набору тренировочных изображений для калибровки исследователей.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, позволяя принимать решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на ранних этапах на основе количественных профилей нейродегенерации.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию мишеней с поправкой на риск с использованием данных о дозозависимости и статистической значимости, полученных при оценке популяций дендритов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с флуоресцентной микроскопией и знание нейроанатомии дофаминергических нейронов C. elegans.
- Необходима инфраструктура для получения изображений, поддерживающая захват z-стеков и проекцию (flattening) изображений для визуализации дендритов.
- Требуется стандартизация между членами команды путем обучения на наборах аннотированных изображений для обеспечения согласованности оценки.
- При применении данной шкалы к различным подтипам нейронов или моделям заболеваний необходимо учитывать особенности адаптации метода.
- Существуют практические ограничения, такие как зависимость от целостности захвата z-стека для полной визуализации дендритов и необходимость обучения специалистов по оценке для минимизации межнаблюдательной вариабельности.
