Измерение потока митохондриального субстрата в рекомбинантных перфринголизиновых O-пермеабилизированных клетках

Потому что он тестирует поток субстрата митохондрий, который может быть затронут различными патологиями или методами лечения. Например, сегодня мы будем использовать его, чтобы выявить реакцию раковых клеток на лечение метформином. Он требует минимального количества клеток, имея при этом достаточные реплики и соответствующий контроль для каждого отдельного материала.

Анализатор предназначен только для исследовательского использования. Этот метод может выявлять ошибки в митохондриальном метаболизме и может быть использован для оценки лекарств воинов, влияющих на митохондрии. Продемонстрировать процедуру будет Каролина Ванецкова, студентка бакалавриата и техник-исследователь из моей лаборатории.

Для начала посева клеток А549 при плотности 20 000 клеток на лунку в колоннах, от двух до 11 микропластинки культуры клеток морского конька XF 96. Оставляя колонны один и 12 пустыми в качестве фоновых колодцев. Заполните пустой Колодец равным объемом клеточной питательной среды, затем инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия в увлажненном инкубаторе с 5% углекислым газом для прикрепления клеток.

Через три-четыре часа добавить 100 микролитров клеточной питательной среды в лунки. Обработайте экспериментальную группу колоннами с семи до 11 одним миллимоляром Метформином, а контрольную группу равным объемом стерильной дистиллированной воды, затем верните пластину в инкубатор. Для гидратации датчиков пипетка 200 микролитров стерильной воды на скважину в подсобную плиту.

Затем осторожно верните картридж датчика, погружая датчик в воду. Инкубируйте картридж в инкубаторе без углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия до следующего дня. Включите анализатор и блок управления.

Запустите программное обеспечение для управления прибором и сбора данных и разработайте протокол анализа, как описано в текстовой рукописи. В соответствии с групповыми определениями создайте четыре стратегии впрыска, где порт A отличается в зависимости от инжектируемой субстрата, и назовите стратегии после субстратов или аббревиатур. Назначьте Олигомицин в порт B, FCCP в порт C и смесь Rotenone Antimycin A в порт D. Создайте и назовите восемь групп, под картой пластин, назначьте группы соответствующим скважинам.

Затем сохраните протокол как готовый к использованию шаблон. Оставьте анализатор включенным, чтобы температура стабилизировалась в течение ночи. На следующий день выбросьте воду с полезной пластины и добавьте 200 микролитров предварительно нагретого калибранта на скважину в полезную пластину.

Верните картридж в инкубатор без углекислого газа до момента анализа. Поддерживайте источник влажности внутри инкубатора и выключите или уменьшите скорость вращения вентилятора до минимума, чтобы избежать быстрого испарения калибранта. Готовят пять миллилитров рабочего раствора субстратов и ингибиторов предварительно нагретым дважды митохондриальным пробирным раствором, 5% BSA и стерильной водой, как описано в тексте рукописи.

Затем загрузите порты инжектора субстратом и ингибиторами, как описано в налоговой рукописи. Для калибровки на вкладке анализа запуска нажмите на начальный запуск, чтобы начать анализ. Вставьте заряженный картридж цензора и дождитесь завершения калибровки.

Приготовьте 20 миллилитров пробирной среды, смешивая два раза митохондриальный пробирный раствор, стерильную воду и 5% BSA в 50-миллилитровой трубке. Добавьте два микролитра 10 микромолярного рекомбинантного перфринголизина O, чтобы получить концентрацию одного наномоляра. И повторно приостановить смесь с щадящим пипетированием, избегая тряски и вихря.

Инкубируйте трубку при температуре 37 градусов Цельсия до использования. Используйте многоканальную пипетку для промывки клеток и пустых колодцев два раза, используя предварительно подогретый раствор PBS без кальция и магния. Отбросьте PBS и добавьте 180 микролитров предварительно подогретой пробирной среды для проницаемости клеток.

Сразу после пермеабилизации замените полезную пластину калиброванного картриджа датчика на пластину ячейки, содержащую пермеабилизированные ячейки, и начните измерение. Группа лечения имела более высокий уровень сукцинат-индуцированного дыхания. Реакция клеток A549 на лечение метформином была выше, чем Hep G2. Для дыхания, индуцированного пируват-малатом, клетки A549 показали повышенную индукцию по сравнению с клетками Hep G2 от пяти до 15 минут.

Аналогичные результаты были получены для дыхания, индуцированного глутамат малатом, и дыхания, индуцированного пальмитоилкарнитин малатом. Для достижения правильной концентрации субстрата и ингибиторов. Нужный том должен быть загружен в нужный порт.

При выявлении изменения метаболического пути определенного субстрата необходимо будет оценить функцию ферментов и транспортеров, участвующих в этом пути.