Восстановление экстракции Msp1 с полностью очищенными компонентами
10 августа 2021 г.
Здесь мы представляем подробный протокол восстановления экстракционной активности Msp1 с полностью очищенными компонентами в определенных протеолипосомах.
Использование AAA-АТФаз для удаления белков из липидного бислоя является общей темой в контроле качества белка. Механистическое понимание этого важнейшего процесса требует воссозданной системы. Предыдущая реконструкция с помощью AAA-ATPases была сложной и неоднородной.
Наша система проста и полностью определена. Это позволяет нам манипулировать AAA-ATPase Msp1, субстратом и липидной средой. Для начала добавьте в ПЦР-трубку предварительно приготовленный восстановительный буфер, очищенные белки msp1 и TA и липосомы, затем инкубируйте смесь на льду в течение 10 минут.
Во время инкубации отрежьте наконечник пипетки P200 примерно до 1/8 дюйма в диаметре. Затем тщательно вихрьте трубку, содержащую bioBeads, чтобы получить однородную смесь. Затем быстро снимите крышку и используйте вырезанный наконечник пипетки P200, чтобы перенести соответствующий объем шариков в пустую трубку ПЦР.
Как только 10-минутная инкубация для восстановления будет завершена, используя неразрезанный наконечник пипетки, удалите всю жидкость из BioBeads. Затем переложите 100 микролитров восстановления в трубку с помощью BioBeads и позвольте ей вращаться на колесе в течение 16 часов. На следующий день вращайте трубку в PicoFuge, чтобы гранулировать бусины, затем перенесите восстановленный материал в чистую трубку ПЦР и держите трубку на льду.
Для удаления белков, которые не смогли восстановиться в липосомах, уравновешивайте спиновые колонки глутатиона экстракционным буфером, который обычно включает в себя три раунда промывки с 400 микролитрами буфера с последующим центрифугированием для удаления буфера. Затем добавьте пять микромолей каждого шаперона к восстановленному материалу, а затем 100 микролитров экстракционного буфера, доведя объем до 200 микролитров. Добавьте эту смесь в уравновешенные спиновые колонки глутатиона, затем заткните спиновые колонны и вращайте их в течение 30 минут, позволяя шаперонам связываться со смолой.
После вращения вращайте колонны ненадолго. Соберите сквозной поток, который представляет собой предварительно очищенный материал, обедненный агрегированными белками. Поместите его на лед и непосредственно приступайте к экстракционному анализу.
Подготовьте трубки для анализа SDS-PAGE. Добавьте 45 микролитров двойной дистиллированной воды во входную трубку, 40 микролитров воды в проточную трубку и 16,6 микролитра 4X SDS-PAGE загрузочного буфера в каждую трубку. Для экстракционного анализа подготовьте реакцию экстракции и доведите конечный объем до 200 микролитров с помощью экстракционного буфера.
Затем предварительно прогрейте экстракционный анализ в тепловом блоке с температурой 30 градусов Цельсия в течение двух минут. Чтобы начать анализ, добавляют АТФ к конечной концентрации в два миллимоля. Вращайте трубку в течение пяти секунд в PicoFuge и высиживайте ее при 30 градусах Цельсия в течение 30 минут.
Во время инкубации возьмите пятимикролитровый образец реакции и добавьте его во входную трубку. Кроме того, уравновешивайте одну спиновую колонку глутатиона для каждого образца в экстракционном анализе, как показано ранее. После завершения 30-минутной инкубации добавьте в трубку 200 микролитров экстракционного буфера, доведя общий объем до 400 микролитров.
Затем добавьте эту реакцию к уравновешенной глутатионной смоле и дайте ей вращаться в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. После вращения раскрутите колонны, чтобы собрать сквозной поток, затем возьмите 10-микролитровый образец для проточной трубки. Промывайте смолу дважды 400 микролитрами экстракционного буфера, отбрасывая проточную поверхность после каждой промывки.
После третьей промывки держите проточную и возьмите 50-микролитровый образец для промывочной трубки. Затем подготовьте пять миллилитров буфера элюирования, добавив восстановленный глутатион к конечной концентрации пяти миллимолей в буфере экстракции. Добавьте 200 микролитров буфера элюирования в спиновую колонку и высиживайте в течение пяти минут.
Затем центрифугируйте колонну и соберите сквозной поток. Повторите шаг элюирования еще раз. После второго элюирования возьмите 50-микролитровую аликвоту из образца элюирования и добавьте ее в трубку элюда.
После проведения вестерн-блот эффективности экстракции можно определить, сравнив количество субстрата в элютивной фракции с входной фракцией. Сигнал в проточном потоке показывает некоторую изменчивость, но в целом похож на входную фракцию, и в дроби промывки нет сигнала. Как правило, существует приблизительно 10% эффективность экстракции для положительного контроля и от одного до 2% эффективности экстракции для отрицательного контроля.
Когда условия восстановления не оптимизированы, уровни экстракции сопоставимы между положительными и отрицательными образцами. Этот метод позволил нашей лаборатории проверить биофизические свойства субстрата, распознающего влияние Msp1.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен подробный протокол реконституции экстракционной активности Msp1 с использованием полностью очищенных компонентов в определенных протеолипосомах. Целью исследования является упрощение процесса реконституции AAA-АТФаз, которые играют ключевую роль в контроле качества белков.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биохимия
- Клеточная биология
Теоретические основы
- AAA-АТФазы играют жизненно важную роль в удалении белков из липидных бислоев.
- Механистическое понимание этого процесса требует использования реконструированной системы.
- Предыдущие методы были сложными и неоднородными.
- В данном исследовании представлена простая и полностью определенная система реконструирования.
Цель исследования
- Для манипулирования AAA-АТФазой Msp1 и её субстратом.
- Для создания определенной липидной среды для исследования.
- Для более глубокого понимания механизмов экстракции белков.
Используемые методы
- Приготовление буфера для реконституции.
- Использование очищенных белков Msp1 и TA.
- Внесение липосом в ПЦР-пробирку.
- Инкубация смеси на льду в течение 10 минут.
Основные результаты
- Был разработан простой и эффективный протокол реконституции Msp1.
- Определенная система обеспечивает более точное манипулирование компонентами.
- Было достигнуто более глубокое понимание процесса экстракции.
- Результаты указывают на повышение эффективности контроля качества белков.
Выводы
- Данное исследование предлагает простой метод изучения AAA-АТФаз.
- Оно вносит вклад в понимание процессов экстракции белков из мембран.
- Этот протокол может быть применен в дальнейших исследованиях контроля качества белков.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный протокол позволяет снизить механистические риски при изучении экстракции белков, опосредованной AAA-АТФазами, — консервативного пути контроля качества, имеющего важное значение для митохондриального протеостаза. Предоставляя полностью определенную реконструированную систему с очищенными компонентами, этот метод способствует валидации мишеней и разработке анализов для заболеваний, связанных с митохондриальной дисфункцией, включая нейродегенерацию и рак. Данный подход повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска за счет изоляции переменных, влияющих на распознавание субстрата и эффективность экстракции.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать роль Msp1 в удалении неправильно локализованных белков с хвостовым якорем, что способствует функциональной валидации мишеней в путях митохондриального протеостаза.
- Операционная ценность: использование очищенного Msp1, TA-белков и липосом позволяет исключить клеточную сложность, обеспечивая точное управление АТФазой, субстратом и липидным окружением.
- Прогностическая ценность: облегчает анализ зависимости «структура-функция» при распознавании субстрата белком Msp1, помогая в идентификации перспективных соединений-модуляторов активности экстракции белков.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: Разработан метод количественного анализа экстракции, при котором эффективность оценивается путем сравнения уровней субстрата в элюате и исходном образце с помощью вестерн-блоттинга.
- Практическая ценность: Определены стандартизированные условия: 10-минутная инкубация на льду для реконституции, 16-часовое вращение с BioBeads и 30-минутная ATP-зависимая экстракция при 30°C с последующим элюированием глутатионом.
- Готовность анализа: Результаты включают эффективность экстракции (обычно ~10% для положительного контроля, 1–2% для отрицательного), что позволяет выявлять хиты и проводить скрининг дозозависимого ответа в формате реконституции.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная значимость: Связывает механизмы митохондриального протеостаза с моделями заболеваний, при которых дисфункция Msp1 играет роль в развитии рака, старении и нейродегенерации.
- Снижение механистических рисков: Изолирует переменные, влияющие на экстракцию, такие как липидный состав и биофизика субстрата, для уточнения взаимодействия с мишенью и уменьшения неопределенности при доклинической валидации мишени.
- Преемственность: Обеспечивает переход от биохимической валидации мишени к фенотипическому скринингу в релевантных моделях заболеваний за счет определения минимального контролируемого модуля экстракции.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод является частью раннего этапа поиска новых лекарственных средств, обеспечивая валидацию мишени посредством механистического анализа экстракции белков; это позволяет оптимизировать разработку анализов для скрининговых каскадов и принимать решения о целесообразности дальнейших исследований на основе данных о взаимодействии с мишенью и модуляции сигнального пути.
- Фундаментальная биология: позволяет проверить гипотезы о влиянии липидного окружения и характеристик субстрата на АТФазную активность Msp1 и эффективность экстракции.
- Скрининг: предоставляет реконструированную количественную платформу для оценки влияния соединений на АТФаз-зависимую экстракцию с использованием определенных положительного и отрицательного контролей.
- Аналитика: обеспечивает получение измеримых данных — эффективности экстракции путем сравнения фракций элюата и исходного материала с помощью вестерн-блоттинга, что позволяет проводить статистическое сравнение различных условий.
- Трансляционные исследования: имеют доклиническую значимость, поскольку моделируют консервативный путь контроля качества, нарушение которого связано с заболеваниями человека.
- Повторное использование в коммерческих целях: определенная система с реконструированными липосомами позволяет использовать данный метод в различных проектах по изучению AAA-АТФаз, специфичности субстратов или липид-зависимой модуляции экстракции.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов за счет снижения механистической неопределенности в путях экстракции белков с помощью упрощенной определенной системы.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и стандартизацию благодаря использованию очищенных компонентов и пошагового протокола (реконституция, обработка BioBead, предварительная очистка от шаперонов, ATP-зависимая экстракция, элюция глутатионом).
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейших разработок, позволяя на ранних этапах оценить потенциал модуляции мишени перед проведением клеточных или фенотипических анализов.
- Влияние на портфель: Способствует приоритизации мишеней в области контроля качества митохондрий с учетом рисков за счет уточнения механистических ограничений и доступности мишени для воздействия.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области очистки белков, реконституции липосом и разработки анализа АТФазной активности.
- Необходим доступ к ультрацентрифуге или PicoFuge для осаждения, спин-колонкам с глутатионом и термоблокам с контролем температуры.
- Для обеспечения воспроизводимой эффективности экстракции в разных лабораториях необходима стандартизация липидного состава, соотношения белок:фосфолипид и концентрации ATP.
- Адаптация метода для других белков TA или AAA-АТФаз может потребовать оптимизации буфера для реконституции, времени инкубации и этапов делипидации липидов с использованием магнитных частиц.
- Практические ограничения включают вариабельность сигнала в проточной фракции и зависимость от чувствительности вестерн-блоттинга для субстратов с низкой концентрацией, как отмечено в источнике.
