DUCT: Двойное литье смолы с последующей микрокомпьютерной томографией для 3D-анализа печени

Этот метод позволяет анализировать, визуализировать и количественно оценивать архитектуру сосудистой и билиарной систем печени в 3D. Теперь мы можем лучше понять пространственные аспекты заболеваний печени и регенерации. Основным преимуществом этой методики является то, что она не опирается на наличие антител или флуоресцентную визуализацию.

Это также позволяет непосредственно визуализировать, какие сети должным образом люменизированы. Этот метод подходит для анализа трубчатых систем, поэтому исследование кровеносных сосудов, желчных протоков и дыхательных путей являются идеальными областями. Мы использовали DUCT, чтобы понять структурные изменения, связанные с билиарной регенерацией.

Прежде чем вводить смолу в желчную систему мыши, начните перемещать кишечник и поджелудочную железу в левую сторону мыши, используя ватный тампон, смаченный PBS, чтобы обнажить общий желчный проток и воротную вену. Затем делают небольшой поперечный разрез в нижней полой вене. Переверните вентральную сторону печени к сердцу, чтобы обнажить висцеральную поверхность и область хилара, и найдите общий желчный проток, который проходит из хилярной области через поджелудочную железу и в кишечник в сфинктере Одди.

Используйте прямые щипцы, чтобы очистить окружающий участок тканей примерно на пять миллиметров от общего желчного протока. Затем, поместив шелковую шовную нить под общий желчный проток, завяжите свободный узел вокруг общего желчного протока. Держите пружинные ножницы плоско против общего желчного протока, чтобы сделать косой разрез к общему желчному протоку в том месте, где общий желчный проток попадает в поджелудочную железу и кишечник рядом со сфинктером Одди.

Затем смешайте один миллилитр желтой смолы с 50 микролитрами отверждающего агента MV и заполните шприц на один миллилитр luer смесью отверждающего агента смолы. Соедините заполненный шприц с трубкой и нажмите на плунжер, чтобы заполнить трубку до тех пор, пока смесь смоляного отверждающего агента не стекает с кончика трубки. Используйте щипцы, чтобы выпрямить область вокруг общего разреза желчного протока.

Перед введением трубки в отверстие в общем желчном протоке с самым длинным краем скошенного кончика вниз по направлению к дорсальной стороне желчного протока. Затем затяните узел шелковой нити, чтобы закрепить трубку внутри общего желчного протока. После введения смолы в общий желчный проток наблюдают за желчным пузырем и отдельными долями печени.

Массируйте печень ватным тампоном, смачиваемым PBS, чтобы помочь равномерно распределить смолу. Заполненные смолой концевые ветви желчных протоков будут слабо видны на поверхности печени. Прекратите инъекцию смолы, когда точки смолы появляются на поверхности печени или когда сопротивление встречается.

Затем снимите трубку, вытащив из общего желчного протока, и быстро затяните шелковый узел с помощью щипцов, чтобы предотвратить утечку смолы. Обрежьте свободные концы шелкового шва, чтобы они не мешали инъекции воротной вены. Перед введением смолы в воротную вену очистите воротную вену от окружающих ее тканей примерно в двух сантиметрах от ее поступления в печень, используя прямые щипцы.

Затем поместите шелковую шовную нить под очищенный участок воротной вены, чтобы завязать свободный узел. В воротной вене дистальнее печени сделайте продольный разрез перед завязыванием узла. Затем подготовьте смесь отверждающего агента зеленой смолы в шприце и заполните трубку смесью, как показано ранее.

Используйте щипцы, чтобы выпрямить воротную вену, вытягивая окружающие ткани к хвостовой стороне, прежде чем вставлять трубку с самым длинным краем скошенного кончика к спинной стороне сосуда. Затяните шелковую нить, чтобы закрепить трубку в воротной вене. После введения смолы в воротную вену наблюдайте, как кровеносные сосуды заполняются смолой, и массируйте печень ватным тампоном, смачиваемым PBS, чтобы помочь распределить смолу.

Когда все кровеносные сосуды заполнены, вытащите трубку из воротной вены и быстро затяните шелковый узел с помощью щипцов, чтобы предотвратить утечку смолы. Для микрокомпьютерной томографии или микроКТ-сканирования рассеченной печени у мыши поместите правую медиальную долю печени в коническую трубку объемом 15 миллилитров и заполните трубку 1%-агарозным гелем примерно до двух третей от общего объема пробирки, чтобы свести к минимуму нежелательное движение образца во время измерения MicroCT. Установите 15-миллилитровую коническую трубку с образцом на вращательную ступень устройства КТ.

Позвольте трубке термически адаптироваться к измерительной камере в течение не менее одного часа. Когда образец термически адаптирован, центрируйте его в поле зрения или FOV, а затем оптимизируйте расстояние до исходного образца и детектора образца или SSD и SDD для достижения достаточного разрешения вокселя. После того, как параметры установлены, начните измерение КТ.

Используйте специальное программное обеспечение для томографической реконструкции для реконструкции данных КТ. Чтобы проанализировать данные КТ, загрузите файлы, выбрав файл, импорт и команду. Используйте функцию определения поверхности на верхней панели, чтобы сегментировать смолу в данных с помощью глобального порогового значения.

В диалоговом окне определите пороговое значение с помощью оценки гистограммы, установив положение красной изозначальной линии, чтобы сегментировать только сосуды, заполненные смолой. На левой панели выберите модуль создания ROI из объема, CAD или сетки, чтобы создать интересующую область или ROI сосудов, заполненных смолой. В диалоговом окне используйте опцию Создать ROI из твердого тела, чтобы выбрать и подтвердить имя обрабатываемого тома.

Исключить ошибочную сегментацию шумовых кластеров в фоновой области данной окупаемости инвестиций. Отметьте рентабельность инвестиций на правой панели, щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав разделенный ROI модуля. В диалоговом окне установите параметр минимальной громкости вокселя, чтобы исключить все частицы шума.

Значение параметра зависит от эксперимента и данных и оптимизировано для каждого анализируемого образца. На левой панели используйте сглаживающий модуль для создания гладких, непрерывных и сплошных масок каналов без артефактов, таких как наличие пузырьков воздуха или утечка смолы в рентабельности затрат смолы. Создайте отдельную рентабельность инвестиций, как описано ранее, для системы, заполненной более абсорбирующей смолой, такой как желтая смола, используемая для инъекции общего желчного протока с более высокими значениями интенсивности в данных КТ.

Пометьте и замаскируйте новую рентабельность инвестиций, щелкнув правой кнопкой мыши, прежде чем выбрать вычесть ROI, а затем вычесть новую рентабельность инвестиций из ROI маски смолы, чтобы создать новую рентабельность инвестиций для оставшейся трубчатой системы. Экспортируйте результирующие ROI для обеих трубных систем в различных форматах на основе ссылок операторов для последующей обработки в различном программном обеспечении. Далее обрабатывайте результирующие ROI в программном обеспечении объемной графики для экспорта окончательной визуализации в виде изображения или видео.

В этом исследовании была достигнута успешная двойная инъекция смолы с хорошо заполненными внутрипеченочными желчными протоками и сосудистой сетью воротных вен. Репрезентативный анализ иллюстрирует результат сегментированных данных от хорошо введенной печени для мыши P15 и взрослой мыши, где смола видна в боковых ветвях. В типичном примере неудачной инъекции физическое повреждение печени во время хирургической процедуры привело к утечке смолы.

Также преждевременное затвердевание смолы в игле или наконечнике трубки перед инъекцией и недостаточная транскардиальная перфузия вызывали недополнение системы. Незначительная утечка смолы может быть исправлена вручную во время сегментации данных MicroCT. Высокое давление впрыска может разорвать сосуды или протоки и необратимо повредить архитектуру сосуда или протока.

Кроме того, пузырьки были еще одним очень распространенным инъекционным артефактом, который привел к разреженному заполнению трубчатых сетей. При использовании свежеоткрытой смолы наблюдалась четкая разница в контрасте между желтыми желчными протоками, вводимыми смолой, и портальными венами, вводимыми зеленой смолой. После трех месяцев хранения контраста оказалось достаточно, чтобы отличить воротную вену от желчного протока.

Однако осаждение повлияло на смешивание двух смол, что было видно как гетерогенное помутнение в заполненной портальной вене. Когда смола была старше шести месяцев, контраст деградировал до такой степени, что было невозможно отличить желтый желчный проток от зеленой впрыскиваемой воротной вены, основываясь только на их контрасте. Крайне важно сделать косой разрез в общем желчном протоке.

В противном случае будет очень сложно вставить трубку. Методика DUCT освещает новые архитектурные механизмы регенерации желчевыводящих путей в клинически значимой модели с отчетливыми особенностями в областях хилярной и периферической долей.