Использование фагового дисплея для разработки модуляторов вариантов убиквитина для лигазов E3

Фаговый дисплей не только помогает нам исследовать характеристики связывания клинически важных ферментов, но и разрабатывать модуляторы для этих ферментов и соответствующих заболеваний. Фаговый дисплей может быть использован для разработки новых связующих для широкого спектра белков-мишеней, а также его легче выполнить, чем другие обычные методы отображения. Эта процедура включала в себя много повторяющихся действий, поэтому ключ заключается в том, чтобы не автопилотировать и оставаться сосредоточенным во всем.

Начните с инокуляции 30 миллилитров тетрациклинового бульона 2YT с 200 микролитрами семенной культуры. Инкубируйте его в течение примерно трех часов при температуре 37 градусов по Цельсию с орбитальным встряхиванием 200 оборотов в минуту, пока бактерии не окажутся в середине фазы. Выбросьте раствор покрытия с пластины в раковину.

Аккуратно высушите его бумажными полотенцами. Затем добавьте 200 микролитров буфера ПБ к каждому хорошо покрытому. Выбросьте буфер ПБ с тарелки и высушите его на бумажных полотенцах.

Добавьте еще 200 микролитров буфера ПБ к каждому покрытому колодцу пластины. Инкубируйте его при комнатной температуре в течение часа с орбитальным встряхиванием 300 об/мин. Разморозьте библиотеку фагов на льду, а затем разбавьте ее в 100 раз больше библиотечного разнообразия в PBS.

Добавьте раствор полиэтиленгликоля натрия хлорида на одну пятую часть разбавленного объема библиотеки и инкубируйте раствор на льду в течение 30 минут. Затем центрифугируют раствор в 11 000 раз G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте супернатант и центрифугируйте его еще на две минуты, чтобы вытащить оставшийся супернатант и сконцентрировать гранулу фага.

Осторожно повторно суспендируйте гранулу фага в одном миллилитре буфера ПБТ на целевой белок, подлежащий анализу, обычно в общей сложности четыре. Добавьте 100 микролитров библиотеки фагов к каждому покрытому колодцу в контрольной пластине. Инкубируйте его при комнатной температуре в течение часа с орбитальным встряхиванием 300 об/мин.

Выбросьте буфер ПБ с целевой пластины в раковину и высушите пластину на бумажных полотенцах. Переложите все 100 микролитров фаговой библиотеки в контрольной пластине на каждый покрытый колодец целевой пластины. Инкубируйте его при комнатной температуре в течение часа с орбитальным встряхиванием 300 об/мин.

Затем извлеките библиотеку фагов из тарелки и четыре раза вымойте покрытые лунки с помощью буфера PT. Переверните тарелку и нажмите на бумажное полотенце, чтобы удалить последние капли буфера. Добавьте 100 микролитров 0,1 молярной соляной кислоты к каждому хорошо покрытому, чтобы элюировать фаг.

Инкубируйте пластину при комнатной температуре в течение пяти минут с орбитальным встряхиванием 300 об/мин. После этого нейтрализуют рН, добавляя 12,5 микролитра рН 11 одного молярного триса гидрохлорида к каждому хорошо покрытому. Перенесите элюированный фаг из всех восьми лунок в одну микроцентрифужную трубку объемом 1,5 миллилитра.

Пипетка вверх и вниз во время переноса, чтобы сделать растворы однородными и аспирировать всю жидкость из скважин. Добавьте 10% BSA к элюированному фагу, чтобы сделать конечную концентрацию 1% Храните трубку микроцентрифуги при четырех градусах Цельсия. Это круглый выход.

Подготовьте семенную культуру для культивирования фагового ввода для следующего раунда селекции путем инокуляции пяти миллилитров культуры семян тетрациклина 2YT изолированной колонией E.coli из агаровой пластины. Высиживайте его ночью при 37 градусах Цельсия с орбитальным сотрясением орбиты 200 об/мин. Развести целевой белок в двух и трех раундах пробирки с соответствующим количеством PBS.

Возьмите половину содержимого двух и трех раундов и покройте четыре лунки на целевой белок в 96-луночной связующей пластине для следующего раунда. Затем используйте половину круглого выхода, чтобы привить три миллилитра среднелогарифмических фазовых ячеек. Высиживайте его при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут с орбитальным встряхиванием 200 об/мин.

Добавьте фаг-хелпер M13KO7 к конечной концентрации 10 миллиардов ПФЕ на миллилитр. Высиживайте его снова при 37 градусах Цельсия в течение часа с орбитальным встряхиванием 200 об/мин. Через час переложить все три миллилитра культуры на 30 миллилитров раствора канамицина 2YT.

Расти ночью при 37 градусах Цельсия с орбитальным сотрясением 200 оборотов в минуту. Репрезентативные результаты выбора варианта убиквитина против UBE4B показаны здесь. UBV были заказаны от самой высокой до самой низкой частоты.

Последовательности представляют собой диверсифицированную область убиквитина в UBV со всеми рандомизированными остатками. Относительное сродство связующих веществ к белку-мишени дикого типа, мутированному белку-мишени, а также нецелевым белкам измеряют с помощью иммуноферментных анализов или ИФА. Все поглощения ИФА были нормализованы по сравнению с 96 средними баллами BSA ELISA и 96 средними баллами GST ELISA.

Более темный зеленый цвет представляет собой более сильную относительную привязку. GST был включен в качестве контроля для неспецифического связывания, потому что целевой белок помечен GST. Результаты ИФА графически представлены здесь.

Ось X представляет UBV, а ось Y представляет соответствующую нормализованную поглощенность. При попытке этой процедуры важно, чтобы вы не выбрасывали раствор в пластину после добавления соляной кислоты. Фаги теперь суспендированы в растворе, и вы хотите сохранить их, чтобы вы могли выполнить последующие окончательные анализы обогащения или и то, и другое.

Следуя этой процедуре, следует выполнить секвенирование для определения частот UBV. Анализы ИФА и IC50 могут быть проведены для определения эффективности связывания и ингибирующей эффективности соответственно, а также для определения того, какие УБВ следует дополнительно охарактеризовать.