Живая визуализация митохондриальной системы в культивируемых астроцитах
16 ноября 2021 г.
В данной статье описан метод митохондриальной покадровой визуализации культур астроцитов, оснащенных биосенсором MitoTimer, и полученный в результате мультипараметрический анализ митохондриальной динамики, подвижности, морфологии, биогенеза, окислительно-восстановительного состояния и оборота.
Этот протокол значительно максимизирует мощность микроскопии как метода отслеживания митохондриальной динамики в отдельных клетках в течение длительных периодов приобретения. В отличие от покадровой съемки на фиксированной группе клеток или на одной клетке за раз, нормализация до исходного уровня для каждого измеренного критерия в каждой клетке контролирует гетерогенность между клетками. С помощью микроскопа, оснащенного автоматизированной платформой и адаптированным вирусным вектором, мы можем использовать этот протокол для любого типа клеток.
Начните с покрытия от 20 000 до 25 000 клеток на квадратный сантиметр в многолуночной посуде и храните их при 37 градусах Цельсия в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа до конца эксперимента. Через восемь дней in vitro добавьте 0,6 пикограмма антигена P24 на клетку лентивирусного вектора, кодирующего митохондриальный биосенсор MitoTimer, разбавленный в фосфатном буферном физиологическом растворе. Через 11 дней in vitro выполните две промывки предварительно подогретым стерильным PBS и добавьте свежую астроцитарную среду без фенолового красного цвета.
Оцените астроцитарную митохондриальную систему по крайней мере через три-пять дней после лентивирусных инфекций LV-G1 MitoTimer. Выберите пять астроцитов на лунку с митохондриальной сетью, экспрессирующей достаточные уровни LV-G1 MitoTimer, используя увеличение в 40 раз. Позаботьтесь о том, чтобы выделить астроциты плоскими и крупными как можно больше и не расположенными в скоплениях клеток.
Затем захватывайте флуоресцентные изображения, используя последовательное возбуждение на 490 нанометров для зеленого канала и 550 нанометров для красного канала с зелеными и красными флуоресцентными сигналами и используя увеличение в 150 раз для каждой координаты. Выберите первый кадр для красного и зеленого каналов для каждой последовательности изображений, щелкнув ND Processing и выбрав кадр. Затем объедините красный и зеленый каналы, выбрав конверсии и объединив канал.
Чтобы исправить затенение изображения, выберите предварительную обработку, а затем автоматическую коррекцию затенения. Примените алгоритм прокатки шара, выбрав предварительную обработку и прокатку шара. Чтобы создать двоичные маски для каждой митохондрии, выберите сегментацию и пороговое значение.
Удалите все объекты, усеченные границей, выбрав двоичную обработку и коснувшись границы. Выберите измерение, а затем площадь объекта, диаметр EEQ, длину, ширину, шероховатость, окружность или относительное удлинение, чтобы измерить площадь поверхности, диаметр, длину, ширину, шероховатость, окружность или относительное удлинение соответственно. Составьте группу с этими измерениями и переименуйте ее в данные MOFO.
Затем выберите измерение, а затем выберите среднюю интенсивность, чтобы измерить среднюю зеленую и красную интенсивности. И соотношение для измерения красного по зеленому соотношению. Теперь композитор группируется с этими измерениями и переименовывает его в данные соотношения.
Наконец, экспортируйте таблицу в CSV-файл, выбрав ссылку и таблицу в CSV, а затем сохраните скрипт анализа GA 3, выбрав Сохранить как.Начните с открытия модуля отслеживания в NIS и выбора просмотра, анализа и отслеживания. Нажмите на определение новой рентабельности инвестиций. С помощью инструмента автоматического обнаружения выберите от 25 до 50 митохондрий на первом изображении последовательности изображений, а затем нажмите на треке автоматического анализа ROI.
При необходимости удалите неправильные дорожки ROI и экспортируйте таблицу в CSV-файл. Вручную регистрируйте преобразования измерений перед обработкой. Для каждого анализа и таймфрейма вручную нормализуйте полученные данные по среднему значению, полученному при эталонном сборе.
Затем выполните статистический анализ, используя двухстороннюю согласованную Nova. Первичная культура астроцитов, инфицированных LV-G1 MitoTimer, демонстрировала сниженные сбалансированные и окисленные митохондриальные сети с различными уровнями фрагментации. До лечения перекисью водорода астроциты, экспрессирующие LV-G1 MitoTimer, демонстрировали гетерогенный размер митохондрий в различных зеленых и красных интенсивностях флуоресценции.
Митохондриальная морфология культур астроцитов была фрагментирована после шести часов инкубации с перекисью водорода. Это было еще более очевидно через 12 часов после обработки без их диаметров с момента уменьшения сферичности. Что касается окислительно-восстановительного состояния и оборота, через три часа после обработки перекисью водорода доля зеленых митохондрий увеличилась в астроцитах.
Относительно динамики и подвижности через три часа после лечения. Все критерии были временно повышены. Эта техника подходит для многих различных вопросов.
Например, в контексте нейродегенеративных заболеваний мы исследуем эстроцитарную токсичность различных молекул, секретируемых в мозге.
Обзор
Эта статья описывает метод митохондриальной иммунологии в режиме реального времени в культурах астроцитов с использованием биосенсора MitoTimer. Она исследует митохондриальную динамику, включая мобильность, морфологию, биогенез, редокс-состояние и оборот из-за различных воздействий.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Методы визуализации
Предпосылки
- Астроциты играют важную роль в функционировании и здоровье мозга.
- Митохондриальная динамика важна для клеточного метаболизма и сигнализации.
- Исследование этой динамики предоставляет представление о нейродегенеративных заболеваниях.
- Отслеживание отдельных клеток с течением времени обеспечивает более детальный анализ.
Цель исследования
- Установить надежный протокол для анализа поведения митохондрий в астроцитах.
- Сравнить свойства митохондрий до и после обработки перекисью водорода.
- Показать применимость метода для различных исследовательских вопросов.
Используемые методы
- Это исследование использует платформу клеточной культуры для визуализации астроцитов.
- Астроциты инфицируются лентивирусным вектором, кодирующим MitoTimer.
- Протокол флуоресцентной визуализации включает регистрацию сигналов на определенных длинах волн.
- Ключевые сроки включают 8 дней in vitro для трансдукции и оценки в различные промежутки времени после обработки.
Основные результаты
- Наблюдалось снижение целостности митохондрий после окислительного стресса.
- Гетерогенность размера митохондрий и их редокс-состояния была отмечена до и после обработки перекисью водорода.
- Динамические поведения, такие как мобильность и морфология, продемонстрировали различные реакции на лечение.
Выводы
- Это исследование эффективно демонстрирует метод для количественной оценки митохондриальной динамики в астроцитах.
- Результаты предоставляют представление о роли окислительного стресса на здоровье астроцитов.
- Такая методология может быть важна для понимания нейродегенеративных механизмов.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This method enables longitudinal tracking of mitochondrial dynamics in astrocytes, supporting target validation in neurodegenerative disease models by linking oxidative stress to measurable changes in mitochondrial morphology and redox state. It provides quantitative, single-cell resolution data that enhances predictive confidence in early discovery by de-risking mechanistic hypotheses about glial contributions to pathology. The approach is applicable to screening mitochondrial modulators in disease-relevant systems, offering translational continuity from in vitro findings to preclinical validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying mitochondrial fragmentation and redox shifts in astrocytes under oxidative stress.
- Operational Value: Enables functional target validation through longitudinal imaging of mitochondrial mobility and biogenesis in live cells.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that normalize mitochondrial dynamics in disease-relevant glial models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized mitochondrial morphology and intensity metrics for high-content screening of neuroprotective agents.
- Quantitative Outputs: Provides red-to-green ratio and morphological parameters (area, length, circularity) as reproducible endpoints for compound screening.
- Scalability: Compatible with automated microscopy platforms for multi-well imaging and batch analysis of mitochondrial responses.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models astrocytic mitochondrial dysfunction implicated in neurodegeneration, enabling mechanistic de-risking of targets.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase imaging with preclinical validation by tracking mitochondrial turnover and redox state over time.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria based on normalization of mitochondrial networks following treatment.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing mechanistic readouts that inform compound selection and optimization in neurodegenerative disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking mitochondrial morphology changes to oxidative stress in astrocytes.
- Screening: Enables assay readiness through standardized mitochondrial biosensor expression and imaging parameters.
- Analytics: Delivers quantitative measurements (mean intensity, ratio, object morphology) for comparing experimental conditions across timepoints.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling redox state and turnover changes relevant to neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for studying mitochondrial dynamics across multiple cell types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in glial mitochondrial responses to stress.
- Operational Value: Ensures reproducibility via baseline normalization and automated image processing workflows.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets through phenotypic screening in astrocytes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by identifying compounds that rescue mitochondrial network integrity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging, lentiviral transduction, and mitochondrial biosensor validation.
- Dependent on automated microscopy platforms with sequential excitation and environmental control.
- Necessitates cross-team standardization of image acquisition and analysis protocols for reproducible results.
- Involves adaptation considerations for different astrocyte sources or disease models.
- Limited by the need for prolonged culture periods and precise timing post-infection for optimal biosensor expression.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Rat Hippocampal Astrocyte Primary Culture
1:25
Long-Term Monitoring of the Mitochondrial System
2:13
Analysis of Individual Mitochondrial Morphology and LV-G1-MitoTimer Ratio
3:54
Analysis of Mitochondrial Motility
4:28
Data Transformation, Normalization, and Statistical Analysis
4:51
Results: Analysis of the Effects of H2O2 on the Mitochondrial System of Astrocytes
5:53
Conclusion
