Магнитная изоляция клеток микроглии от новорожденной мыши для первичных клеточных культур
25 июля 2022 г.
Первичные культуры микроглии обычно используются для оценки новых противовоспалительных молекул. Настоящий протокол описывает воспроизводимый и релевантный метод магнитной изоляции микроглии от новорожденных детенышей.
Этот протокол позволяет культивировать микроглию в условиях, близко имитирующих характеристики in vivo. Используя технологию сортировки магнитных клеток, наш протокол позволяет нам стимулировать микроглию только два дня in vitro, без использования какой-либо сыворотки в питательной среде. Для начала используйте небольшие ножницы, чтобы разрезать кожу от шеи до носа, следуя за сагиттальным швом от 15 до 20 миллиметров.
Вставьте кончики с большим отверстием, параллельным черепу. Вырежьте с каждой стороны до глаз. Разрезайте между глазами маленькими ножницами, чтобы отделить череп и мозг от головы.
Двумя щипцами схватите череп близко к обонятельным луковицам и осторожно порвите череп. Лезвием бритвы удалите мозжечок и обонятельную луковицу и разрежьте мозг на две части. Поместите кусочки мозга в чашку Петри, содержащую 40 миллилитров HBSS без кальция и магния.
Приготовьте диссоциационную смесь согласно этой таблице. Переложите 12 кусочков мозга в трубку С общим весом 1,2 грамма на диссоциационную трубку. Затем поместите трубки С на диссоциатор с нагревом.
Запустите оптимизированную программу NTDK в диссоциаторе. Центрифуга на 20 секунд. Завершите механическую диссоциацию, трижды пипетировав.
Переложите ячейки на четыре 15-миллилитровые трубки с прикрепленными сетчатыми фильтрами. Смойте ситечки 10 миллилитрами HBSS кальцием и магнием. Центрифугируйте в течение 10 минут и удалите супернатант с помощью 10-миллилитровой пипетки.
Осторожно добавьте 10 миллилитров HBSS с кальцием и магнием и повторно суспендируйте гранулу. Опять же, центрифугируйте и удалите супернатант. Повторно суспендировать гранулу с шестью миллилитрами сортировочного буфера.
Повторите центрифугирование и выбросьте супернатант. Затем добавьте 200 микролитров раствора микрогранул CD11b и инкубируйте пробирки в течение 15-20 минут при четырех градусах Цельсия. После инкубации повторно суспендировать гранулу с шестью миллилитрами сортировочного буфера.
Повторите центрифугирование и повторно суспендируйте гранулу с восемью миллилитрами сортировочного буфера. Затем следуйте программе Possel на сепараторе, чтобы подготовить восемь колонок. Пропустите ячейки через столбец, добавляя по одному миллилитру клеточной суспензии за раз.
С помощью одного миллилитра сортировочного буфера элюируют CD11b-положительные клетки на стерильной пластине элюирования. Объедините ячейки в 50-миллилитровую трубку. Центрифугируйте и повторно суспендируйте гранулу с 10 миллилитрами холодной микроглиевой среды.
Подсчитайте CD11b-положительные клетки. Повторно суспендировать клетки в холодной среде микроглии, чтобы получить конечную концентрацию от 650 000 до 700 000 клеток на миллилитр. Дозировать суспензию в пластинах клеточной культуры.
Инкубируйте пластины в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию с 5% углекислым газом. На следующий день замените среду предварительно нагретой средой микроглии и повторите ночную инкубацию. Стимулируйте клетки перед этим этапом и выполняйте фагоцитарный анализ в течение последних трех часов стимуляции.
Рассчитайте количество бусин согласно этой таблице в соотношении 50 бусин на ячейку. Приготовьте смесь бисера. Высиживать трубку в течение одного часа на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия.
Вихрь каждые 10 минут. К каждой лунке добавить рассчитанный объем бисерного раствора и инкубировать в течение трех часов. Используя этот подход, фагоцитарную активность микроглии оценивали после стимуляции провоспалительными факторами, такими как интерлейкин-1 бета, плюс интерферон гамма или липополисахариды.
После стимуляции в течение шести-24 часов флуоресцентные шарики микроглии Cy3 анализировали с помощью конфокального микроскопа. Через шесть часов микроглия начинает фагоцитарными шариками Cy3 только при интерлейкине-1 бета плюс интерферон гамма-состоянии. Через 24 часа наблюдалось увеличение флуоресценции Cy3 для обоих видов стимуляции, что подчеркивало повышенную фагоцитарную активность.
Чистота культуры микроглии была повышена с помощью проточной цитометрии, которая показала увеличение жизнеспособности клеток после сортировки. С помощью проточной цитометрии и маркеров популяции клеток RT-qPCR были проанализированы до и после сортировки CD11b-положительных клеток из мозга мышей на восьмой послеродовой день. Эти анализы различали различные популяции клеток мозга, такие как CX3CR135 для микроглии, O4 или OLIG2 для олигодендроцитов, NeuN или синаптофизин для нейронов и ACSA-2 или GFAP для астроцитов.
После сортировки клеток с использованием антитела CD11b были получены только микроглии. Важно очень осторожно добавлять суспензию в колонну, чтобы предотвратить засорение и избежать механической гибели клеток. После этого метода можно выполнить транскриптомную протеомику, такую как западная кровь, или Luminex, и даже иммунохимию, чтобы увидеть эффект стимуляции микроглии.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен воспроизводимый протокол выделения первичной микроглии из новорожденных мышей с использованием технологии магнитного сортинга. Данная методика позволяет культивировать микроглию в условиях, максимально приближенных к характеристикам in vivo, что дает возможность изучить ее фагоцитарную активность.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Клеточная биология
- Исследования микроглии
Теоретические основы
- Микроглия играет важнейшую роль в центральной нервной системе.
- Понимание реакций микроглии на различные стимулы имеет большое значение для исследований нейровоспаления.
- Магнитная сепарация клеток представляет собой эффективную стратегию изолирования микроглии.
- Предыдущие протоколы могли отличаться недостаточной воспроизводимостью или несоответствием условиям in vivo.
Цель исследования
- Разработать протокол для эффективного выделения и культивирования первичных микроглии.
- Обеспечить возможность оценки реакций микроглии на воспалительные стимулы.
- Оценить чистоту и жизнеспособность выделенной микроглии.
Используемые методы
- Метод культивирования клеток с использованием магнитной сортировки для выделения микроглии из новорожденных мышей.
- Биологическая модель включает микроглию коры головного мозга новорожденных щенков.
- Для оценки чистоты клеток применялись иммунохимия и проточная цитометрия.
- Основные этапы включают диссекцию, ферментативную диссоциацию и сортировку с использованием микросфер CD11b.
- Фагоцитарные тесты позволили оценить активность микроглии в ответ на провоспалительные факторы.
Основные результаты
- Микроглия продемонстрировала повышенную фагоцитарную активность в ответ на специфические воспалительные условия.
- Повышенная жизнеспособность и чистота клеток были подтверждены с помощью проточной цитометрии после сортировки.
- Конфокальная микроскопия выявила выраженные различия в фагоцитарной активности в зависимости от продолжительности стимуляции.
- Данный метод позволил четко разграничить различные популяции клеток головного мозга.
Выводы
- В данном исследовании разработан надежный метод выделения микроглии мыши для экспериментов in vitro.
- Полученные результаты расширяют понимание функций микроглии и ее реакций на воспаление.
- Данный протокол служит основой для дальнейших исследований нейровоспалительных процессов.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
В данном протоколе представлен воспроизводимый метод выделения первичной микроглии из новорожденных мышей, что позволяет создавать физиологически релевантные модели in vitro для исследований нейровоспаления. Благодаря достижению высокой степени чистоты и жизнеспособности клеток с помощью магнитной сортировки по маркеру CD11b, данный подход способствует механистическому снижению рисков при валидации мишеней и разработке анализов для изучения заболеваний ЦНС. Метод повышает прогностическую достоверность доклинического скрининга за счет сохранения функциональности и состояний активации микроглии, которые максимально приближены к условиям in vivo.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать фенотипы активации микроглии и провоспалительные реакции, имеющие значение для гипотез о нейроонтогенетических и нейродегенеративных заболеваниях.
- Практическая ценность: предоставляет стандартизированную безсывороточную систему культивирования, которая снижает биологическую вариабельность и обеспечивает воспроизводимость исследований по взаимодействию с мишенями.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественно оцениваемые показатели фагоцитоза и транскрипционной активности для скрининга соединений-модуляторов воспалительных путей.
- Практическая ценность: обеспечивает масштабируемый и воспроизводимый рабочий процесс изоляции, совместимый с использованием многолуночных планшетов и анализов стимуляции с временным курсом.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает моделирование патологических процессов за счет сохранения маркеров идентичности микроглии (например, CX3CR1) и функциональных ответов на такие стимулы, как IL-1β/IFN-γ и LPS.
- Практическая ценность: Обеспечивает трансляционную преемственность от этапа открытия до доклинической валидации благодаря стандартизированной очистке и функциональной проверке с помощью проточной цитометрии и конфокальной микроскопии.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод является частью этапа ранних открытий, обеспечивая получение валидированных первичных клеток для проверки гипотез, подготовки анализов и генерации данных, которые используются для идентификации ведущих соединений и оценки доклинических рисков.
- Фундаментальная биология: позволяет снизить риски при изучении механизмов за счет выделения микроглии для уточнения роли сигнальных путей в нейровоспалительных процессах.
- Скрининг: обеспечивает получение готовых к анализу клеток с количественным определением фагоцитарной активности и уровней мРНК для скрининга соединений и исследований модуляции мишеней.
- Аналитика: поддерживает количественное измерение зависимых переменных, включая фагоцитарную активность (поглощение микросфер Cy3) и экспрессию генов (RT-qPCR) для сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивает сохранение фенотипической достоверности и экспрессии маркеров, что способствует согласованию биомаркеров и преемственности при доклинической валидации.
- Повторное корпоративное использование: создает универсальную платформу выделения, применимую в нескольких проектах по изучению функций микроглии в моделях заболеваний ЦНС.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: Повышает уверенность в валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности с помощью физиологически релевантных моделей микроглии.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и стандартизацию благодаря магнитной сортировке и определенным условиям культивирования, что минимизирует вариабельность между партиями.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя надежные доклинические данные о модуляции мишеней и профилях воспалительного ответа.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию мишеней ЦНС с учетом рисков на основе валидированных данных о взаимодействии с микроглией и функциональных результатах.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт в области диссекции тканей новорожденных, ферментативной диссоциации и методов магнитного сортинга клеток.
- Необходимо наличие доступа к клеточным сортерам (например, MACS), центрифугам и стерильной инфраструктуре для культивирования тканей.
- Необходима стандартизированная подготовка реагентов и соблюдение времени инкубации для обеспечения стабильного выхода и жизнеспособности CD11b-положительных клеток.
- Адаптация к другим модельным системам или стадиям развития может потребовать оптимизации параметров диссоциации и сортинга.
- Практические ограничения включают механическую чувствительность при пропускании через колонку, что требует осторожного пипетирования во избежание засорения и повреждения клеток.
