Программное количественное измерение толщины остеоартритной субхондральной кости
18 марта 2022 г.
В этой методологической статье представлен программный протокол количественного измерения для количественной оценки толщины гистологической субхондральной кости в мышиных остеоартритных коленных суставах и нормальных коленных суставах в качестве контроля. Этот протокол очень чувствителен к тонкому утолщению и подходит для обнаружения ранних остеоартритных субхондральных изменений кости.
Утолщение субхондральной кости, или склероз, является одним из признаков остеоартрита, как у животных моделей, так и у людей. В настоящее время выраженность гистологического субхондрального утолщения кости в основном определяется визуальной оценкой на основе полуколичественных систем классификации. Это исследование направлено на разработку воспроизводимого и легко выполняемого протокола для количественного измерения толщины субхондральной кости в мышиной модели ОА колена, вызванной дестабилизацией медиального мениска.
Мы создали мышиную модель остеоартрита коленного сустава путем хирургической дестабилизации медиального мениска, которая выполняется под хирургическим микроскопом и стерильным состоянием. Гистологический процесс коленных суставов мыши включает фиксацию тканей, декальцинацию, обрезку, обработку, встраивание, сечение и окрашивание с последующей микроскопической визуализацией. Изображение на экране показывает остеоартрит коленного сустава мыши с поражением суставного хряща, образованием остеофита и утолщением субхондральной кости Количественное измерение остеоартритной субхондральной кости с помощью программного обеспечения ImageJ.
Загрузите ImageJ с imagej.nih.gov/ij. Откройте ImageJ. Перейдите на вкладку Файл и нажмите кнопку Открыть, чтобы открыть гистологическое изображение.
Найдите адрес каталога файла, выберите файл рисунка и нажмите кнопку Открыть. С помощью инструмента «Прямая линия» набросайте одну единицу длины, микрометр, и нажмите «Анализировать», а затем «Задать масштаб». Установите известное расстояние и пропорции пикселей равными единице и нажмите Ok.ImageJ может преобразовать длину пикселя в единицу длины, микрометр.
Установите измеряемый коэффициент в область. Нажмите «Анализировать», затем «Установить измерение» и установите флажок «Область и предел порога» в новом окне. Этот шаг настраивает ImageJ для измерения области параметров в пределах выбранного порогового значения.
Определена общая область субхондральной кости, представляющая интерес, как показано в радио, которое охватывает субхондральную кортикальную пластинку и часть нижележащей трабекулярной кости, прилегающую к кортикальной пластине. Набросайте контур общей субхондральной области кости с помощью инструмента выделения под главным окном изображения. Инструменты выбора дают системе пороговое значение для ограничения измерения после выбора порога.
Щелкните Анализ, затем Измерение. Откроется окно результатов с измерением площади. Нажмите «Изменить», затем «Очистить снаружи», чтобы исключить область за пределами общей области субхондральной кости.
После нажатия кнопки Очистить снаружи видна только общая площадь субхондральной кости. Нажмите «Изображение», затем «Настроить», затем «Порог цвета», чтобы открыть окно цветового порога. Нажмите кнопку Оригинал в нижней части порогового цветового окна, чтобы восстановить исходное состояние изображения.
Используйте инструменты выделения, чтобы нарисовать небольшую коробочку в области костного вещества. Щелкните Параметр образца в нижней части окна, чтобы определить область костного вещества. Выбранная область костного вещества превратится в красную.
Нажмите кнопку Выбрать в нижней части окна цветового порога, чтобы создать порог измерения области. Нажмите «Анализ», затем «Измерение» в главном меню ImageJ. Результат измерения площади костного вещества будет отображаться в окне результатов.
Сохраните данные общей площади субхондральной кости и площади костного вещества. Меж- и внутринаблюдательная изменчивость и воспроизводимость определялись анализом коэффициентов корреляции Пирсона. Значимость различий между исследовательскими группами определялась с помощью студенческого t-теста или одностороннего ANOVA, за которым следовал пост-специальный тест.
На этом рисунке показаны верхние и нижние панели. На верхней панели показаны микрофотографии гистологических изображений из групп Sham и DMM для визуальной оценки субхондральной классификации костей. Нижние панели показывают микрофотографии гистологических изображений из групп Sham и DMM для количественного субхондрального измерения кости с помощью ImageJ.
Поля, очерченные пунктирной желтой линией, выполненной с помощью Adobe Illustrator, определяют общую область подхондральной кости, представляющую интерес. Область костного вещества внутри коробок выделена оранжевым цветом. Замечательное утолщение субхондральной кости в медиальном мыщелке бедренной кости и медиальном плато большеберцовой кости можно количественно оценить с помощью программного обеспечения ImageJ.
На этом рисунке тесты вариаций между наблюдателями указывают на высокую воспроизводимость между наблюдателями как для первого, так и для второго измерения толщины субхондральной кости в медиально-большеберцовом плато и медиальных областях мыщелка бедренной кости, представляющих интерес. На этом рисунке внутринаблюдательные вариационные тесты указывают на высокую воспроизводимость между измерениями толщины первой и второй субхондральной кости в медиальном плато большеберцовой кости и медиальных областях мыщелка бедренной кости, представляющих интерес. В таблице 1 приведен сравнительный анализ воспроизводимости между визуальной классификацией и количественным измерением толщины субхондральной кости с помощью ImageJ.
Тест коэффициента корреляции показывает, что количественное измерение было относительно более воспроизводимым, чем система визуальной оценки. На этом рисунке показан сравнительный анализ чувствительности визуальной градации и количественное измерение толщины субхондральной кости с помощью ImageJ в медиальном мыщелке бедренной кости и медиально-большеберцовом плато. Гистологические изображения для визуальной оценки были разделены на три группы.
Количественное значение толщины субхондральной кости от всех трех наблюдателей для изображений DMM с нулевой визуальной оценкой было значительно выше, чем у изображений Sham с нулевой визуальной оценкой, что указывает на то, что количественное измерение более чувствительно, чем визуальное градация к легкому утолщению субхондральной кости. Недавно разработанный протокол количественного измерения толщины остеоартритной субхондральной кости более чувствителен к легким субхондральным изменениям кости, чем широко используемые системы визуальной классификации. И этот протокол может быть использован для выявления ранних остеоартритных субхондральных изменений костей и для оценки эффективности in vivo лечения остеоартрита в сочетании с классификацией хряща остеоартрита.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье по методологии представлен протокол количественного измерения с использованием программного обеспечения для определения гистологической толщины субхондральной кости в коленных суставах мышей с остеоартритом и в нормальных коленных суставах в качестве контроля. Протокол разработан с высокой чувствительностью к незначительному утолщению, что делает его подходящим для выявления ранних остеоартритных изменений.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Исследования остеоартрита
- Гистология
Теоретическая часть
- Утолщение субхондральной кости является характерным признаком остеоартрита.
- Современные методы основаны на визуальной оценке и полуколичественной градации.
- Для точного измерения необходим воспроизводимый протокол.
- В исследовании используется мышиная модель, индуцированная дестабилизацией медиального мениска.
Цель исследования
- Разработать протокол количественного измерения толщины субхондральной кости.
- Повысить чувствительность выявления ранних остеоартритических изменений.
- Предоставить стандартизированный метод для последующих исследований.
Используемые методы
- Хирургическая дестабилизация медиального мениска у мышей.
- Гистологическая обработка, включая фиксацию, декальцинацию и окрашивание.
- Микроскопическая визуализация для анализа.
- Количественное измерение с использованием программного обеспечения ImageJ.
Основные результаты
- Успешное создание мышиной модели остеоартрита коленного сустава.
- Демонстрация поражений суставного хряща и образования остеофитов.
- Достигнута количественная оценка утолщения субхондральной кости.
- Протокол демонстрирует высокую чувствительность к изменениям толщины кости.
Выводы
- Разработанный протокол позволяет точно измерить толщину субхондральной кости.
- Данный метод может способствовать более глубокому пониманию прогрессирования остеоартрита.
- Будущие исследования могут использовать этот протокол для дальнейшего изучения остеоартрита.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Количественное измерение толщины субхондральной кости устраняет критический пробел в валидации мишеней при остеоартрите, заменяя субъективную визуальную оценку воспроизводимым анализом с помощью программного обеспечения. Этот подход повышает достоверность прогнозов в доклинических моделях, позволяя выявлять ранние, малозаметные структурные изменения, которые предшествуют явной деградации хряща. Данный метод способствует снижению механистических рисков при разработке терапевтических средств от ОА, предоставляя стандартизированный, транслируемый биомаркер путей ремоделирования костной ткани.
Стратегические области применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы, направленные на пути ремоделирования субхондральной кости при остеоартрите.
- Практическая ценность: Обеспечивает количественные и воспроизводимые показатели для функциональной валидации мишеней в моделях остеоартрита у мышей.
- Прогностическая ценность: Помогает в приоритизации портфеля препаратов за счет выявления легкого утолщения кости, которое невозможно определить с помощью систем визуальной оценки.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных гистологических образцов для стандартизированного высокопроизводительного анализа с использованием ImageJ.
- Количественные результаты: Получение непрерывных, независимых от порога измерений площади субхондральной кости для скрининга соединений.
- Масштабируемость: Возможность повторного использования платформы в исследованиях OA с согласованным определением областей интереса в медиальном мыщелке бедренной кости и плато большеберцовой кости.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболевания: Соответствует патологии остеоартрита (OA) у человека, при котором субхондральный склероз является признаком прогрессирования заболевания.
- Трансляционная преемственность: Связывает этапы фундаментальных исследований и доклинических рабочих процессов, предоставляя биомаркер, совместимый с оценкой степени повреждения хряща.
- Принятие решений с учетом рисков: Обосновывает критерии принятия решения о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) на основе количественных изменений толщины кости в исследованиях эффективности терапии.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный протокол вписывается в континуум разработки методов лечения остеоартрита — от валидации мишени и оптимизации ведущих соединений до оценки доклинической эффективности, особенно в тех случаях, когда основным механизмом является ремоделирование костной ткани.
- Открывающая биология: Обеспечивает проверку гипотез относительно мишеней, участвующих в склерозе субхондральной кости и механотрансдукции.
- Скрининг: Предоставляет готовые к анализу, воспроизводимые количественные данные для оценки влияния соединений на толщину кости.
- Аналитика: Позволяет проводить статистическое сравнение толщины кости между группами с использованием корреляции Пирсона, t-критерия и ANOVA, как описано в протоколе.
- Трансляционные исследования: Связывает результаты с доклинической валидацией, предлагая биомаркер, который отражает клинические показатели прогрессирования ОА.
- Корпоративное повторное использование: Создает воспроизводимый рабочий процесс гистологического анализа, применимый для различных моделей ОА и групп терапии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность валидации мишеней за счет снижения неопределенности при оценке фенотипа костной ткани.
- Операционная ценность: стандартизирует измерения между разными исследователями и сессиями при низкой внутри- и межгрупповой вариабельности.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки за счет выявления ранних структурных изменений, которые упускаются при полуколичественной оценке.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять продвижение проектов с учетом рисков на основе чувствительных количественных конечных точек ремоделирования кости.
Особенности реализации
- Требуется опыт в гистологической подготовке и анализе пороговых значений в ImageJ.
- Результат зависит от калибровки микроскопа и единообразного определения исследуемой области.
- Для обеспечения воспроизводимости необходима межгрупповая стандартизация протоколов измерений.
- При адаптации метода следует учитывать особенности анатомии костной ткани конкретной модели и протоколы окрашивания.
- Практическое ограничение: ручное обведение контуров может привести к вариабельности результатов, если определения исследуемых областей строго не стандартизированы.
