Автоматизация количественной оценки агрегатов в Caenorhabditis elegans
14 октября 2021 г.
Следующий протокол описывает разработку и оптимизацию высокопроизводительного рабочего процесса для культивирования червей, флуоресцентной визуализации и автоматизированной обработки изображений для количественной оценки агрегатов полиглутамина в качестве оценки изменений в протеостазе.
Был принят простой подход к мониторингу изменений в протеостазе путем оценки агрегации полиглутамина и предоставления структуры, которая может быть использована для приложений с высокой пропускной способностью. Оценка фенотипа, такого как количество агрегатов по I, может стать субъективной. Автоматизация подсчета агрегатов позволяет устранить такую предвзятость, увеличить пропускную способность и воспроизводимость.
Этот метод помогает идентифицировать бактериальные гены, способствующие нарушению протеостаза хозяина. Понимание вклада отдельных бактериальных генов поможет нам понять его значение в патогенезе таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера, Паркинсона и Хантингтона. Начните с удаления пластин, содержащих червей, из морозильной камеры и дайте им оттаять при комнатной температуре.
Затем протрите лишнюю конденсацию и снимите крышку перед визуализацией. Используйте настройки микроскопа со временем экспозиции 500 миллисекунд, увеличением 40 X с адаптером камеры 0,63 X и интенсивностью GFP, установленной на 100% во время захвата изображения. Теперь отрегулируйте элементы управления проходящим светом до тех пор, пока черви не окажутся ярко освещенными по сравнению с темным фоном, избегая передержки.
Измените положение червей внутри скважины, чтобы предотвратить чрезмерное слипание, используя наконечник пипетки 10 микролитров, чтобы осторожно подтолкнуть червей в нужное положение. Установите для канала фильтр GFP для создания фокальной плоскости для обоих изображений. Захват изображения яркого поля.
Сделайте соответствующее флуоресцентное изображение, не нарушая пластину и не изменяя фокус микроскопа. Теперь, чтобы оценить изображения, сначала загрузите CellProfiler. Откройте программное обеспечение и перетащите интересующие изображения в поле изображений.
Нажмите на изображения в списке файлов, чтобы открыть их. Выберите лупу, чтобы выделить интересующую область, и значок стрелки, чтобы измерить длину червей и агрегатов. Наведите курсор на нужный объект, чтобы определить его значение интенсивности, которое можно увидеть в нижней части экрана.
Чтобы использовать конвейер анализа изображений CellProfiler, назовите пары изображений правильно, как описано в текстовой рукописи после загрузки CellProfiler с официального сайта. Загрузите конвейер и загрузите его в CellProfiler, выбрав файл, импорт и конвейер из файла. Выберите модуль «Распутанные черви», чтобы открыть его настройки для загрузки обучающего набора, используемого для идентификации червей в модуле «Распутанные черви».
Затем определите имя файла обучающего набора. Выберите значок загрузки файла и загрузите дополнительный файл. Загрузите изображения, выбрав модуль изображений в левом верхнем углу.
А затем перетащите правильно названные изображения. Перед анализом изображений выберите нужную выходную папку, которая будет использоваться для хранения результатов, нажав на кнопку настроек вывода, расположенную в левом нижнем углу программы. Затем выберите значок папки справа от выходных данных по умолчанию, чтобы выбрать желаемое местоположение вывода.
Выберите значок анализа изображений, чтобы начать анализ изображений. Если анализ занимает слишком много времени и застрял, обрабатывая одно изображение, прервите запуск и определите необработанное изображение, отсортировав выходную папку и отметив, какое имя изображения не найдено. После полного анализа программное обеспечение организует результаты в электронную таблицу Excel, содержащую отдельных червей в столбце N, и соответствующее количество агрегатов в столбце K.Загрузите организатор метаданных, чтобы удобно организовать данные из выходного CSV-файла из CellProfiler.
Для ОС Windows найдите загруженный файл и извлеките его в нужное место. Найдите и откройте извлеченную папку с именем gui_Windowsos_64x. И запустите приложение, нажав на значок приложения с графическим интерфейсом.
Может открыться запрос на получение разрешения на запуск. Выберите дополнительную информацию, а затем нажмите «Запустить» в любом случае. Организатор метаданных теперь готов к перетаскиванию выходных CSV-файлов CellProfiler.
Для Mac OS найдите загруженный файл и извлеките файл приложения организатора метаданных файла. Откройте извлеченную папку, найденную в загрузках. Щелкните правой кнопкой мыши на графическом интерфейсе приложения и выберите Открыть.
Появится запрос на разрешение на открытие из-за отсутствия официальной лицензии. Выберите Открыть. Как только ваше приложение организатора метаданных будет открыто в соответствующей ОС, нажмите «Загрузить файлы здесь» или перетащите нужные CSV-файлы CellProfiler.
Нажмите на кнопку упорядочить, которая приведет пользователя на новый экран с кнопкой загрузки файлов. Нажмите на кнопку и выберите нужное место для сохранения выходного файла. Выходной файл будет отображаться как исходное имя файла с расширением _organized, добавленным к имени файла.
В присутствии FUDR черви, которых кормили различными бактериями, имели более последовательный размер тела, что позволяло более равномерно и точно обнаруживать червей, тем самым решая проблему переполненности. Замораживание червей улучшило обнаружение агрегатов polyQ за счет устранения фоновой флуоресценции, а также точность автоматического подсчета, сопоставимую с ручным подсчетом. Инвертированное яркое освещение использовалось для обнаружения всего канала C.elegans и GFP для изображения агрегатов polyQ YFP.
Обнаружение, распутывание червей и агрегированная количественная оценка для каждого червя были выполнены путем применения оптимизированного конвейера обработки изображений CellProfiler, который позволяет получить количество агрегатов на одного отдельного червя. Разница между эффективностью автоматизированной агрегированной количественной оценки и использованием конвейера CellProfiler была минимальной, что указывает на то, что автоматизированный метод может быть применен к крупномасштабным экранам. Из 90 протестированных бактериальных штаммов колонизация кишечника C.elegans одним кандидатом показала значительное снижение количества агрегатов.
Эксперименты по подтверждению методом ручного подсчета показали, что ни один из мутантов, включая того, который значительно уменьшил количество агрегатов, не повлиял на агрегацию polyQ. Исследователи, решившие использовать эту структуру, должны понимать, что описанные шаги не являются абсолютными. Модификация и фундаментальное понимание того, как манипулировать CellProfiler, необходимы для успеха.
Дополнительные биохимические подходы, такие как вестерн-блоттинг, могут быть использованы для подтверждения агрегации polyQ.
Обзор
Это исследование разрабатывает высокопроизводительный рабочий процесс для культивирования червей, флуоресцентного имAGING и автоматизированной обработки изображений для количественной оценки агрегатов полиглутамина как показателя изменений в протеостатисе. Метод улучшает оценку этих агрегатов, особенно при изучении их роли в нейродегенеративных заболеваниях.
Ключевые компоненты исследования
Область исследования
- Протеостатис
- Нейродегенеративные заболевания
- Высокопроизводительное скрининг
Фон
- Агрегация полиглутамина связана с заболеваниями, такими как Альцгеймер, Болезнь Паркинсона и Хортона.
- Понимание вклада бактериальных генов в нарушение протеостатиса важно.
- Традиционные методы оценки агрегатов могут быть субъективными.
Использованные методы
- Высокопроизводительное имAGING и анализ с использованием CellProfiler
- C. elegans как биологическая модель
- Автоматизированная количественная оценка агрегатов полиглутамина
Основные результаты
- Автоматизированная обработка изображений позволяет устранить смещения и повысить воспроизводимость при подсчете агрегатов.
- Идентифицированы бактериальные гены, влияющие на протеостатис хозяина, с значительными результатами по количеству агрегатов в червеях.
- Полученные результаты показывают, что автоматизация сопоставима с ручным подсчетом, поддерживая крупномасштабные скрининги.
Выводы
- Это исследование предоставляет надежный фреймворк для изучения протеостатиса через агрегацию полиглутамина.
- Полученные знания из этого метода актуальны для понимания механизмов в нейродегенеративных заболеваниях.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Automating aggregate quantification in C. elegans addresses the need for high-throughput, bias-free assessment of proteostasis in neurodegenerative disease models. By standardizing image acquisition and CellProfiler-based analysis, the method enables reproducible screening of large compound or genetic libraries. This supports early target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines for protein conformational diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying polyglutamine aggregation as a proxy for proteostasis disruption.
- Operational Value: Reduces subjectivity in phenotypic scoring, improving data reliability for target validation campaigns.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing quantitative, reproducible readouts for mechanism-based compound prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative aggregate counts per worm, enabling robust assay readouts for screening campaigns.
- Operational Value: Increases throughput and reproducibility through automation, reducing manual labor and inter-operator variability.
- Assay Readiness: Produces structured output (Excel spreadsheet with worm and aggregate counts) compatible with downstream data analysis workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links C. elegans proteostasis models to human neurodegenerative disease mechanisms via conserved polyQ aggregation pathways.
- Mechanistic De-risking: Facilitates identification of bacterial or genetic modifiers of aggregation, supporting target validation in disease-relevant systems.
- Predictive Confidence: Enables cross-functional teams to compare conditions using normalized, automated aggregate quantification.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing quantitative proteostasis readouts that inform go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on proteostasis mechanisms by enabling objective, high-content aggregation phenotyping.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized worm imaging and analysis compatible with 96-well or larger format screens.
- Analytics: Produces quantifiable dependent variable measurements (aggregates per worm) that allow statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects invertebrate model findings to human disease pathways through conserved aggregation biology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis pipeline adaptable to multiple proteostasis targets and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by eliminating bias from manual aggregate counting.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized image processing and automated data output.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling large-scale screens with reduced hands-on time and higher data quality.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions through reliable, quantitative proteostasis biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with fluorescence microscopy and GFP/YFP imaging parameters for polyQ detection.
- Depends on CellProfiler software and associated pipeline configuration for automated worm and aggregate segmentation.
- Necessitates standardized image naming and folder organization for successful batch processing.
- Benefits from FUDR treatment to reduce worm size variability and improve detection accuracy in high-density wells.
- Relies on user training to adapt the pipeline for different worm strains, expression patterns, or imaging setups.
