Производство липидных наночастиц, нагруженных siRNA, с помощью микрофлюидного устройства
22 марта 2022 г.
Методы производства липидных наночастиц на микрофлюидной основе (LNP) привлекли внимание в системах доставки лекарств (DDS), включая доставку РНК. Этот протокол описывает процессы изготовления, производства LNP (lNP-loaded lNP) и оценки LNP с использованием нашего оригинального микрофлюидного устройства под названием iLiNP.
Размер наночастиц липидов влияет на биораспределение, противоопухолевый эффект и эффективность глушения генов. Таким образом, метод контроля размера LNP является эффективным методом получения нанопрепаратов, включая системы доставки РНК. Это оригинальное микрофлюидное устройство, названное устройством iLiNP, было способно контролировать размер LNP в диапазоне от 20 до 100 нанометров с интервалом 10 нанометров.
Устройство iLiNP может производить не только LNP, нагруженные siRNA, но и все LNPS, нагруженные мРНК, и LNP, загруженные рибонуклеопротеином. Для начала возьмите растворы липидного этанола и получите растворы LNP, загруженные siRNA, путем смешивания растворов DOTAP, DSPC, холестерина и DMG-PEG2k с молярным соотношением от 50 до 10 до 38,5 до 1,5. Отрегулируйте общую концентрацию липидов до восьми миллимоляров.
Затем берут водные растворы 154 миллимолярного физиологического раствора и 25-миллимолярного ацетатного буфера при рН 4 и фильтруют их через мембранные фильтры 0,2 микрометра или шприцевые фильтры. Готовят буферный раствор siRNA, растворяя 70 мкг siGL4 в одном миллилитре 25-миллимолярного ацетатного буфера. Наполните один миллилитр стеклянных шприцев липидными и водными растворами соответственно.
Соедините стеклянные шприцы с пиковым капилляром с помощью шприцевых разъемов, затем установите скорость потока липидных и водных растворов и введите липидные и водные растворы отдельно в устройство iLiNP с помощью шприцевых насосов. Соберите суспензии LNP в микропробирку с выходного отверстия устройства iLiNP. Диализируйте суспензию LNP с использованием диализной мембраны от 12 до 14 килодальных отсечек молекулярной массы при четырех градусах Цельсия в течение ночи против физиологического раствора или DPBS для POPC LNP и siRNA,нагруженных LNP, соответственно.
Соберите диализированные суспензии LNP в микротрубки, а затем пипеткой от 20 до 30 микролитров суспензии LNP в микрокварцевую ячейку. Наконец, измерьте размер LNP, распределение LNP по размерам и индекс полидисперсности динамическим рассеянием света. Здесь показано распределение по размерам POPC LNP при различных условиях потока, таких как общий расход и коэффициенты расхода.
Точные размеры LNP в диапазоне от 20 до 100 нанометров можно контролировать с помощью этого устройства iLiNP. Малогабаритные LNP формируются при высоких условиях общего расхода. Кроме того, размеры LNP, которые образуются на FRR 5, меньше, чем у FRR 3, независимо от общего расхода.
Распределение размеров нагруженных миРНК LNP показано здесь. siRNAs инкапсулируются в LNP путем электростатического взаимодействия между катионным липидом DOTAP и отрицательно заряженными siRNAs. Устройство iLiNP производило 90-нанометровые сиРНК-нагруженные катионные LNP с узким распределением.
Эффективность инкапсуляции siRNA составила 95% из-за электростатического взаимодействия между катионным липидом и отрицательно заряженными siRNAs. Оценивали цитотоксичность и активность глушения генов 19-нанометровых LNP, нагруженных сиРНК. сиРНК-нагруженные LNP показали цитотоксичность в дозе от 10 до 100 наномолярных siRNA.
Уровень экспрессии люциферазы снижался в зависимости от концентрации siRNA. LNP, нагруженные siRNA, подавляли экспрессию люциферазы на 80% в дозе 100 наномолярных siRNA. Оптимизация условий потока является наиболее важным шагом в протоколе для получения LNP желаемого размера.
Метод производства LNP на микрофлюидной основе, включая устройство iLiNP, не требует какой-либо сложной процедуры и, как ожидается, будет использоваться в качестве стандартного метода производства LNP.
Обзор
В данной статье представлен протокол получения липидных наночастиц (ЛНЧ), нагруженных siRNA, с использованием микрофлюидного устройства iLiNP. Данный метод позволяет точно контролировать размер ЛНЧ, что имеет решающее значение для создания эффективных систем доставки лекарственных средств.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Системы доставки лекарств
- Липидные наночастицы
- Микрофлюидика
Теоретические сведения
- Размер липидных наночастиц влияет на биораспределение и терапевтическую эффективность.
- Контроль размера ЛНЧ необходим для оптимизации доставки РНК.
- Устройство iLiNP позволяет контролировать размер в диапазоне от 20 до 100 нанометров.
- Электростатические взаимодействия способствуют инкапсуляции siRNA в ЛНЧ.
Цель исследования
- Разработать надежный метод получения липидных наночастиц (ЛНЧ), нагруженных siRNA.
- Оценить влияние размера ЛНЧ на эффективность сайленсинга генов.
- Оптимизировать условия потока для достижения желаемых характеристик ЛНЧ.
Используемые методы
- Приготовление липидных и водных растворов для получения ЛНЧ.
- Использование устройства iLiNP для смешивания и формирования ЛНЧ.
- Диализ суспензий ЛНЧ для удаления избытка материалов.
- Метод динамического рассеяния света для измерения размера и распределения ЛНЧ.
Основные результаты
- Устройство iLiNP позволило получить ЛНП, нагруженные siRNA, размером 90 nanometers с эффективностью инкапсуляции 95%.
- Малые ЛНП формировались в условиях высокой общей скорости потока.
- ЛНП, нагруженные siRNA, продемонстрировали цитотоксичность и эффективное сайленсинг генов.
- Оптимизация условий потока имела решающее значение для достижения желаемого размера ЛНП.
Выводы
- Микрофлюидный метод с использованием устройства iLiNP упрощает производство LNP.
- Ожидается, что данный подход позволит стандартизировать производство LNP в исследовательских целях.
- В дальнейших исследованиях можно изучить применение этого метода в различных системах доставки РНК.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Точный контроль размера липидных наночастиц (LNP) имеет решающее значение для оптимизации биораспределения, терапевтической эффективности и показателей сайленсинга генов в системах доставки лекарств на основе РНК. Микрофлюидное устройство iLiNP обеспечивает воспроизводимое производство LNP с регулируемым размером от 20 до 100 нанометров, что поддерживает рабочие процессы валидации мишеней и идентификации ведущих соединений на ранних стадиях. Эта возможность повышает прогностическую достоверность в доклинических моделях за счет снижения вариабельности характеристик наночастиц, что является ключевым фактором снижения рисков при трансляционном продвижении.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет исследовать зависимость биологической активности от размера для LNP, нагруженных siRNA, в анализах по валидации мишеней.
- Практическая ценность: Обеспечивает стандартизированные рецептуры LNP для снижения уровня шума при фенотипическом скрининге и исследованиях по снижению механистических рисков.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: получение монодисперсных siRNA-LNP с определенным размером и эффективностью инкапсуляции 95% для надежной оценки соединений.
- Практическая ценность: обеспечение стандартизации анализа за счет воспроизводимого контроля размера LNP путем регулировки скорости потока в устройстве iLiNP.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: способствует установлению корреляции между размером LNP, эффективностью сайленсинга генов и цитотоксичностью в системах, релевантных для конкретных заболеваний.
- Практическая ценность: обеспечивает масштабируемое производство LNP, нагруженных мРНК, siRNA и рибонуклеопротеинами, для обеспечения преемственности в доклинических исследованиях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Микрофлюидный метод iLiNP вписывается в непрерывный процесс разработки — от раннего подтверждения мишени и идентификации ведущих соединений до доклинических исследований, что особенно актуально для РНК-терапии, где эффективность зависит от доставки частиц определенного размера.
- Биология открытий: обеспечивает проверку гипотез за счет систематического варьирования размера LNP для оценки влияния на клеточный захват и взаимодействие с мишенью.
- Скрининг: позволяет получать готовые к анализу составы LNP с однородным распределением по размеру и высокой степенью инкапсуляции siRNA для воспроизводимого скрининга соединений.
- Аналитика: предоставляет количественные данные о размере, полидисперсности и дзета-потенциале с помощью метода динамического рассеяния света для принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки.
- Трансляционные исследования: связывают оптимизацию LNP на этапе открытий с доклинической оценкой посредством использования стандартизированных нанолекарственных препаратов с контролируемым размером.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для производства различных LNP, нагруженных РНК (siRNA, mRNA, RNP), в рамках нескольких проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность выбора мишени за счет установления связи между физико-химическими свойствами LNP и функциональными результатами, такими как сайленсинг генов.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и масштабируемость производства LNP благодаря точности микрофлюидики.
- Стратегическая ценность: Снижает биологические риски на поздних стадиях за счет возможности ранней оценки и минимизации рисков, связанных с эффективностью средств доставки.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию кандидатов в РНК-терапевтические препараты с учетом рисков на основе эффективности доставки.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области приготовления липидных рецептур, работы с микрофлюидикой и загрузки нуклеиновых кислот.
- Необходимы шприцевые насосы, стеклянные шприцы и оборудование для диализа с целью очистки LNP.
- Требуется стандартизация соотношений скоростей потока и условий общего потока между исследовательскими группами.
- Необходимо учитывать особенности адаптации при изменении состава липидов или типов РНК-груза.
- Ограничено необходимостью проведения диализа после производства и использования метода динамического рассеяния света для контроля качества.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:54
Preparation of Lipid Solutions and the siRNA/ Buffer Solution
1:58
Set-Up of the iLiNP Device and Production of LNPs
2:35
Dialysis of the LNP Suspension and LNP Size Measurement
3:24
Results: POPC LNP Size Distributions Produced by the iLiNP Device at Different Flow Rate Ratios and Characterization and Cytotoxicity of siRNA-Loaded LNPs
5:22
Conclusion
