Пиросеквенирования: Простой метод для точного генотипирования

Генетические исследования получили значительный импульс после расшифровки последовательности генома человека. Пиросеквенирование представляет собой уникальную систему, позволяющую анализировать генетические вариации, аллельный дисбаланс РНК, статус метилирования ДНК и число копий генов. В данном видео мы демонстрируем базовую реакцию пиросеквенирования для генетического анализа.

Здравствуйте, я Кристи Кинг из лаборатории доктора Чарльза Эби и доктора Брайана Гейджа кафедры внутреннего медицины медицинского факультета Вашингтонского университета. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру пиросеквенирования. Этот метод полезен тем, что он является одним из самых тщательных, но в то же время простых способов анализа однонуклеотидных полиморфизмов (SNP).

Пиросеквенирование основано на методе секвенирования путем синтеза, использующем высвобождение пирофосфата при каждом включении нуклеотида в открытую трех-праймовую цепь ДНК. После загрузки планшета нуклеотиды включаются в соответствии с последовательностью, заданной программным обеспечением. Высвобожденный пирофосфат участвует в реакции, приводящей к высвобождению ATP, который используется люциферазой для преобразования люциферина в оксилюциферин, что вызывает излучение света. Излучаемый свет регистрируется ПЗС-камерой и записывается в виде пиков, называемых пирограммами.

Все нуклеотиды, не включенные в цепь ДНК, расщепляются AP-пирофосфатазой для предотвращения появления фонового шума. Данная процедура включает следующие этапы: разработка анализа, электрофорез продуктов ПЦР в геле для контроля качества и пиросеквенирование.

Итак, приступим к пиросеквенированию. Для проведения пиросеквенирования сначала необходимо подготовить продукт ПЦР. ПЦР для пиросеквенирования требует большего количества циклов, чем большинство ПЦР, чтобы гарантировать полное расходование всех праймеров — примерно 50 циклов.

Пиросеквенирование также требует, чтобы один из праймеров ПЦР был биотинилирован. Наконец, важно отметить, что также необходим внутренний праймер. Для исключения контаминации эффективный дизайн анализа может быть выполнен с помощью программного обеспечения, предоставляемого для пиросеквенирования.

Для подтверждения наличия ПЦР-продукта следует провести электрофорез в геле для нескольких образцов, а также для отрицательного контроля. Для подготовки планшета для пиросеквенирования добавьте 12 µL смеси праймеров для пиросеквенирования в 96-луночный планшет для пиросеквенирования. Для этого потребуется смесь из 43,2 µL внутреннего праймера и 1396,8 µL отжигающего буфера; закройте планшет для пиросеквенирования адгезивной пленкой.

Если подготовка занимает более 50 минут, в каждую лунку 96-луночного PCR-планшета добавьте 70 мкл смеси SRO speed mix, содержащей 240 мкл стрептавидин-покрытых микросфер sero speeds, 560 мкл связывающего буфера, состоящего из трис-натрия, хлорида натрия, EDTA и tween 20, и 3600 мкл воды, после чего плотно закройте крышку. Поместите 96-луночный PCR-планшет со смесью микросфер на шейкер для планшетов на пять минут при комнатной температуре.

Убедитесь, что крышка плотно закрыта, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение между лунками. Этот этап обеспечит thoroughе связывание стрептавидин-ENC-покрытых сфер с биотиновым тегом, который находится на ПЦР-праймере. Подготовьте рабочее место для подготовки планшетов.

Сюда входят кюветы для реагентов, лоток для смеси ПЦР-продукта и бусин, а также лоток для праймеров пиросеквенирования. Убедитесь, что планшет со смесью ПЦР-продукта и бусин, а также лоток для праймеров пиросеквенирования выровнены правильно, чтобы негативные контроли находились в одной ориентации. Перед переносом образцов встряхните выключенный вакуумный инструмент в чистой воде, чтобы удалить с него любые остатки бусин или загрязнения.

Слейте оставшуюся воду, снова наполните кювету и включите вакуумный насос. Оставьте наконечник вакуумного устройства в кювете до полного удаления воды, что занимает примерно 30 секунд. Поместите фильтрующие наконечники вакуумного устройства в лунки планшета со смесью ПЦР-гранул и удерживайте их до полного удаления жидкости из планшета.

Для предотвращения поверхностного натяжения можно использовать осторожное покачивание. Поместите вакуумный наконечник в кювету с 70% ethanol, когда жидкость начнет течь по трубке. Позвольте фильтрующим наконечникам впитывать ethanol в течение пяти секунд.

Повторите процедуру для 0,2 молярного раствора гидроксида натрия, который денатурирует ДНК до одноцепочечного ПЦР-продукта, и для промывочного буфера. Это необходимо для очистки и нейтрализации ПЦР-продукта. Отсоедините вакуумный шланг от вакуумного инструмента и поместите вакуумный инструмент в плашку для пиросеквенирования, содержащую праймер для пиросеквенирования в смеси с буфером для отжига.

Если вакуумный шланг все еще подключен, при погружении в планшет для пиросеквенирования смесь праймеров будет всосана. Кончики наконечников приведут к потере вашего ПЦР-продукта. Аккуратно встряхните или покачайте наконечники вакуумного устройства в лунках планшета для пиросеквенирования, чтобы распределить ПЦР-продукт.

После завершения встряхивания или раскачивания извлеките вакуумный инструмент из планшета для пиросеквенирования, снова подсоедините его к шлангу и поместите в чистую воду для промывки перед использованием со следующим планшетом. Поместите планшет для пиросеквенирования на термоблок на две минуты при 80 °C. Через две минуты снимите планшет с термоблока и поместите его на охлаждающую поверхность.

После охлаждения планшет можно накрыть адгезивной пленкой, за исключением случаев, когда анализ будет запущен в течение 15 минут, чтобы предотвратить испарение. Теперь можно приступить к пиросеквенированию. Первым этапом пиросеквенирования является ввод данных о проведенном анализе в компьютер.

В разделе simplex выберите «new entry» и введите информацию об анализе, включая идентификатор (ID) и последовательность для анализа, которая предоставляется программным обеспечением для разработки анализа и позволяет осуществлять контроль качества; выберите порядок дозирования (dispensation order), который определяет последовательность вокруг SNP с учетом контрольных оснований. Наконец, выберите гистограммы, чтобы получить визуальное представление о том, как должна выглядеть ваша пикограмма. Теперь можно приступить к запуску анализа SNP.

На вкладке «Запуски» (runs) и во вкладке «Общие» (general) введите название запуска и выберите параметры прибора для данного запуска. Перейдите на вкладку «Настройка» (setup), выберите запись об анализе, затем нажмите и перетащите её на планшет. При внесении выбранного анализа в планшет важно отметить, что использовать весь планшет необязательно: вы можете деактивировать отдельные лунки для анализа, а также проводить множество различных анализов на одном и том же планшете.

Перейдите на вкладку «Вид» (view) и выберите «Запуск» (Run). На этой странице указаны соответствующие объемы нуклеотидов, фермента и субстрата, необходимые для проведения анализа. Перед использованием очистите наконечники для нуклеотидов или капилляров, а также наконечники для реагентов.

Заполните наконечники водой и надавите на верхнюю часть наконечника, чтобы проверить его на наличие засоров. Если вода не вытекает из нижней части наконечника, несколько раз опорожните и снова заполните его, чтобы попытаться протолкнуть воду. Если наконечник остается заблокированным, его можно подвергнуть воздействию ультразвука.

Утилизируйте наконечники и возьмите новые. Перед использованием фермент и субстрат следует ресуспендировать в воде. Чтобы избежать образования пузырьков воздуха, которые могут привести к засорению наконечников или неравномерному дозированию, неиспользованные ресуспендированные фермент и субстрат можно хранить при температуре минус 20 градусов Цельсия.

Для последующего использования капиллярных дозирующих наконечников в микроцентрифужной пробирке приготовьте разведение нуклеотидов в буфере TE P8 в соотношении 1:1. Перед использованием тщательно перемешайте. Заполните наконечники с нуклеотидами и реагентами соответствующими объемами в соответствии с количеством, рекомендованным программным обеспечением.

Осторожно распределяйте жидкость по стенкам наконечников, чтобы предотвратить попадание в них пузырьков воздуха и последующее засорение. Обязательно проверьте наконечники для дозирования нуклеотидов на наличие пузырьков воздуха. Если пузырьки обнаружены, осторожно постучите по стенкам наконечников, пока пузырьки не поднимутся на поверхность, или удалите их с помощью чистого наконечника пипетки.

После заполнения картриджа проведите анализ тестовой планшета. Поместите картридж в прибор для пиросеквенирования, а тестовый планшет — на платформу для 96-луночных планшетов. Наложение адгезивной пленки на планшет позволяет легко наблюдать за дозированием реагентов и нуклеотидов.

Выберите вкладку «Инструмент» (instrument) в левой части экрана, затем нажмите «Управление» (manage). Выберите нужный инструмент из выпадающего списка. Нажмите «Тест» (test), после чего появится предупреждение.

Система запросит подтверждение того, что тестовая планшета установлена в прибор. Нажмите «ОК». После завершения процедуры извлеките тестовый планшет; в центре планшета над шестью лунками должны быть видны капли жидкости, соответствующие четырем нуклеотидам, ферменту и субстрату.

Если количество маленьких точек меньше шести, произошла закупорка; в этом случае следует проверить наконечники и удалить любые засоры. Поместите планшет на платформу для 96-луночных планшетов пиросеквенирования. Закройте все рычаги и нажмите «запуск» (run) для данного планшета.

Настройте запуск, при котором фермент, субстрат и нуклеотиды будут подаваться в заранее определенном порядке. После того как пиросеквенатор проанализирует запуск, необходимо изучить полученные результаты. Синие лунки указывают на прохождение генотипа и пиросеквенирования.

Лунки, отмеченные оранжевым цветом, требуют вмешательства оператора; их можно отредактировать, нажав на интересующую лунку и открыв соответствующую прогнозируемую гистограмму. Можно присвоить генотипу статус «пройдено», «не пройдено» или «проверено», а также соответствующим образом изменить сам генотип. После редактирования лунки на карте планшета появится темный круг.

Отрицательные контроли должны быть оценены как отрицательные. В лунках с отрицательным контролем могут наблюдаться неспецифические пики, однако обычно это вызвано образованием петель внутреннего праймера. Таким образом, мы продемонстрировали вам способ секвенирования полиморфизма в геноме человека.

Пиросеквенирование ДНК предпочтительнее других методов секвенирования, так как оно применимо для широкого спектра задач. Этот метод также достаточно надежен для работы с ДНК из любого источника, включая образцы с низкой концентрацией и деградировавшую ДНК. При выполнении данной процедуры важно помнить, что исходным материалом должен быть чистый ПЦР-продукт.

Для каждого анализа используйте отрицательный контроль и убедитесь в качестве всех ваших реагентов. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в проведении ваших экспериментов.