Пиросеквенирования: Простой метод для точного генотипирования

Генетические исследования получили большую пользу от публикации последовательности генома человека. Пиросеквенирование — это уникальная система, которая позволяет анализировать генетическую изменчивость, а также аллельный дисбаланс РНК, ДНК, статус метилирования и количество копий генов. В этом видео мы демонстрируем базовую реакцию пиросеквенирования для генетического анализа.

Здравствуйте, я Кристи Кинг из лаборатории доктора Чарльза Эби и доктора Брайана Гейджа на кафедре внутренней медицины Медицинской школы Вашингтонского университета. Сегодня мы покажем вам процедуру пиросеквенирования. Эта процедура полезна, потому что это один из самых тщательных и простых методов, используемых для анализа SNP.

Пиросеквенирование основано на секвенировании путем синтеза с использованием преимуществ высвобождения пирофосфата всякий раз, когда нуклеотид встраивается в открытую цепь ДНК с тремя простыми нитями. После высвобождения пирофосфат используется в реакции, которая приводит к высвобождению TP, который используется люциферазой для преобразования люцифера в окси-люцифер, что приводит к излучению света. Полученный свет собирается ПЗС-камерой и записывается в виде пиков, также известных как поджигатели.

Любые нуклеотиды, не включенные в цепь ДНК, разрушаются AP pyra для предотвращения фонового шума. Эта процедура включает в себя следующие этапы. Дизайн анализа, ПЦР-гель электрофорез для контроля качества и пиросеквенирования.

Итак, давайте начнем с пиросеквенирования. Для того, чтобы выполнить пиросеквенирование, сначала необходимо подготовить продукт для ПЦР. ПЦР для пиросеквенирования требует больше циклов, чем большинство ПЦР, чтобы гарантировать, что весь праймер будет использован примерно за 50 циклов.

Пиросеквенирование также требует, чтобы один из праймеров ПЦР был биотинилирован. Наконец, важно отметить, что также требуется внутренняя грунтовка. Эффективный дизайн анализа может быть выполнен с помощью программного обеспечения, предоставленного с помощью пиросеквенирования, чтобы гарантировать отсутствие загрязнения.

А чтобы подтвердить наличие ПЦР-продукта, следует провести гель на нескольких образцах, а также провести отрицательный контроль. Чтобы сделать пластину пиросеквенирования, добавьте 12 микролитров грунтовочной смеси для пиросеквенирования в 96-луночную пластину пиросеквенирования. Для этого требуется смесь из 43,2 микролитров внутреннего грунтовки, вместе с 1396,8 микролитрами буфера для колена покрыть пластину пиросеквенирования клейкой пленкой.

Если установка займет более 50 минут, в каждую лунку из 96 лунок ПЦР препарата добавьте 70 микролитров SRO speed mix, которая содержит 240 микролитров стрептавидина, покрытых серо-скоростным покрытием. 4,560 микролитров связующего буфера, который изготовлен из трисса натрия хлорида, ЭДТА и 20 и 3, 600 микролитров воды и надежно закройте крышкой. Поместите 96 луночную пластину для продукта ПЦР со смесью шариков в шейкер для тарелок на пять минут при комнатной температуре.

Убедитесь, что крышка надежно закрыта, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение между лунками. Этот этап позволит тщательно встать на колени стрептококка ENC, покрытых шариками сфероса к метке биотина, которая находится на праймере ПЦР. Установите рабочую станцию для подготовки пластин.

Это включает в себя желоба для реагентов, лоток для продукта ПЦР и смеси шариков, а также лоток для праймера пиросеквенирования. Убедитесь, что планшет для продукта ПЦР и смеси шариков, а также лоток для праймера пиропоследовательности правильно выровнены, чтобы негативы находились в одной ориентации. Перед переносом образцов встряхните вакуумный инструмент, который выключен в чистой воде, чтобы выпустить любые шарики или мусор, которые могут на нем быть.

Слейте остатки воды, наполните корыто и включите пылесос. Оставьте вакуумный инструмент в кормушке до тех пор, пока вся вода не будет удалена, что составляет примерно 30 секунд. Поместите фильтрующие наконечники вакуумного инструмента в лунки пластины для смеси шариков PCR и оставьте их до тех пор, пока вся жидкость не будет удалена с пластины.

Для предотвращения поверхностного натяжения можно использовать мягкое покачивание. Поместите вакуум в желоб с 70% этанолом, когда жидкость начнет течь по трубке. Дайте наконечникам фильтра всосать этанол в течение пяти секунд.

Повторите то же самое для 0,2 молярного гидроксида натрия, который денатурирует ДНК до одноцепочечной ПЦР, и для промывочного буфера. Для очищения и нейтрализации продукта ПЦР. Отсоедините вакуумный шланг от вакуумного инструмента и поместите вакуумный инструмент в пластину пиропоследовательности, содержащую капсюль пиропоследовательности в буферной смеси для коленования.

Если вакуумный шланг все еще подсоединен, при помещении в пластину пиропоследовательности грунтовка будет всасываться через него. Советы, из-за которых вы теряете продукт для ПЦР. Осторожно встряхните или покачайте кончики вакуума в лунках планшета для пиросеквенирования, чтобы рассеять продукт ПЦР.

Снимите вакуумный инструмент с пластины пиропоследовательности после завершения встряхивания или раскачивания, снова подключите пылесос к шлангу и поместите инструмент в чистую воду, чтобы очистить его для следующей пластины. Поместите пластину пиропоследовательности на термоблок на две минуты при температуре 80 градусов Цельсия. Через две минуты достаньте тарелку из нагревательного блока и поставьте на прохладную поверхность.

После охлаждения и нанесения клейкой пленки можно использовать для покрытия пластины, если только пластина не будет запущена в течение 15 минут для предотвращения испарения. И теперь пришло время начать пиросеквенирование. Первым шагом пиросеквенирования является ввод данных анализа в компьютер.

В разделе «Односторонняя запись» выберите новую запись и введите информацию об анализе, включая имя идентификатора и последовательность для анализа, которая предоставляется программным обеспечением для разработки анализа и позволяет контролировать качество и выбирать порядок выдачи, который обеспечивает последовательность вокруг SNP плюс контрольные базы. Наконец, выберите гистограммы, чтобы визуально показать, как должна выглядеть ваша пиграмма. Теперь пришло время начать прогон ножниц.

Под прогонами снипа и вкладкой общие введите имя прогона и выберите параметры прибора для прогона. На вкладке настройки выберите запись пробирного анализа, щелкните и перетащите ее на пластину. Чтобы ввести выбранный анализ в планшет, важно отметить, что не обязательно использовать всю планшет, в котором вы можете инактивировать разные лунки для анализа, а также на одной планшете может быть проведено множество различных анализов.

Перейдите на вкладку просмотра и выберите нужный вариант. Бежать. На этой странице перечислены соответствующие объемы нуклеотидов, фермента и субстрата, необходимые для прогона. Перед использованием очистите наконечники нуклеотидов или капилляров и реагентов.

Наполните наконечники водой и надавите на верхнюю часть наконечника, чтобы проверить, нет ли засоров наконечника. Если вода не брызжет со дна кончика, опорожните и наполните несколько раз, чтобы попытаться протолкнуть воду. Или вы можете обработать наконечники ультразвуком, если наконечник остается заблокированным.

Отбрасывайте и получайте новые советы. Перед использованием фермент и субстрат должны быть повторно суспендированы водой. Если встряхивание пузырьков воздуха может привести к закупорке наконечника или неравномерному распределению, неиспользованный ресуспендированный фермент и субстрат могут храниться при температуре минус 20 градусов Цельсия.

Для дальнейшего использования в качестве наконечников для капиллярного диспенсирования в микропробирке сделайте разведение один к одному нуклеотидами и буфером P восемь. Хорошо перемешайте перед использованием. Заполните наконечники нуклеотидов и реагентов соответствующими объемами в соответствии с количеством, предложенным программным обеспечением.

Аккуратно распределите жидкость по бокам наконечников, чтобы предотвратить попадание в них пузырьков воздуха и закупорку. Обязательно проверьте наличие пузырьков воздуха в дозирующих наконечниках нуклеотидов. Если в них присутствуют пузырьки воздуха, просто постучите по боковым сторонам наконечников, пока пузырьки воздуха не выйдут на поверхность, или выбейте их чистым наконечником для дозатора.

Запустите тестовую пластину после заполнения картриджа. Поместите картридж в прибор для пиросеквенирования, а тестовую пластину - в платформу 96-луночной пластины. Наложение клейкой пленки на планшет позволяет легко увидеть дозирование реагентов и нуклеотидов.

Выберите вкладку инструментов в левой части экрана, затем нажмите «Управление». Выберите инструмент из выпадающего меню. Нажмите «Тест», и появится предупреждение.

Просьба проверить, установлена ли тестовая пластина в приборе. Нажмите OK. После завершения снимите тестовую пластину и в середине пластины должны быть жидкие точки над шестью лунками, представляющими четыре нуклеотида, фермент и субстрат.

Если имеется менее шести мелких точек, произошла закупорка, и наконечники следует проверить и удалить любые засоры. Поместите планшет на 96 лунку платформы для пиросеквенирования. Закройте все рычаги и нажмите кнопку «Выполнить» на отдельной пластине.

Запустите ферментный субстрат и нуклеотиды будут распределяться в заданном порядке. После того, как прогон был проанализирован пиросеквенсором, пришло время изучить прогон. Синие колодцы представляют проходящий генотип и пиро.

Оранжевые скважины требуют вмешательства человека и могут быть отредактированы путем нажатия на интересующую скважину и открытия прогнозируемой гистограммы. Генотип может быть пройден, отклонен или проверен, а также сам генотип может быть изменен соответствующим образом. После редактирования скважины на карте на табличке появится темный круг.

Отрицательный контроль должен быть оценен как отрицательный. В отрицательных лунках могут быть неспецифические пики, однако, как правило, это вызвано зацикливанием внутреннего праймера. Итак, мы только что показали вам, как секвенировать полиморфизм в геноме человека.

Пиросеквенирование ДНК полезно по сравнению с другими процедурами секвенирования, поскольку оно может быть адаптировано к широкому спектру применений. Он также достаточно надежен для обработки ДНК из любого источника, включая ДНК с низкой концентрацией и деградировавшую ДНК. При выполнении этой процедуры важно помнить, что начинать нужно с хорошего чистого продукта для ПЦР.

Включите отрицательный контроль для каждого анализа и убедитесь, что все ваши реагенты исправны. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.