Обнаружение Indel после мутагенеза CRISPR/Cas9 с использованием анализа расплава высокого разрешения у комаров Aedes aegypti
10 сентября 2021 г.
В этой статье подробно описывается протокол быстрой идентификации инделов, индуцированных CRISPR/Cas9, и выбора мутантных линий у комара Aedes aegypti с использованием анализа расплава с высоким разрешением.
Этот протокол является очень простым и эффективным способом обнаружения мутантов, генерируемых технологией CRISPR / Cas9 от многочисленных людей. Два основных преимущества этой техники заключаются в том, что ее можно сделать за несколько часов и что она применима к множеству организмов. Дизайн грунтовки может быть сложным для определенных генов, и для повышения эффективности HRMA может потребоваться несколько раундов проектирования и проверки праймера.
Чтобы выполнить градиентную ПЦР, начните с приготовления мастер-микса. Затем удалите 19 микролитров мастер-микса для нешаблонного контроля или NTC в 96-луночной пластине. Затем добавьте шаблон в оставшийся мастер-микс.
Aliquot 20 микролитров образца смешивают в 96-луночную пластину. Выполните ПЦР, следуя параметрам цикла, а затем сгенерируйте профили термического расплава, используя параметры, упомянутые в рукописи. После сбора всего необходимого материала подготовьте мастер-микс с 0,5 микролитрами реагента высвобождения ДНК и 20 микролитрами буфера разбавления на человека, подлежащего генотипированию.
Используя многоканальную пипетку, аликвотировать 20 микролитров смеси в ПЦР-пластину и оставить ПЦР-пластину на льду. Затем поместите обезболенных комаров G1 в стеклянную чашку Петри, чтобы держать их седативными, и поместите восемь комаров дикого типа во вторую чашку Петри. Протрите пару пинцетов 70% этанолом и используйте продезинфицированный пинцет, чтобы удалить одну из задних лап комаров.
Затем погружают ножку в раствор реагента высвобождения ДНК. Поместите комара в соответствующий флакон и закройте флакон губкой. После этого протрите пинцет 70% этанолом, прежде чем приступить к удалению ноги от следующего комара, пока не будет завершена 96-луночная пластина.
Затем запечатайте пластину оптическим уплотнением ПЦР-пластины и инкубируйте пластину ПЦР, содержащую ножки при комнатной температуре, в течение двух-пяти минут с последующей инкубацией при 98 градусах Цельсия в течение двух минут. Дайте пластине остыть до комнатной температуры. Для ПЦР подготовьте мастер-микс, содержащий предпочтительные компоненты, а затем используйте многоканальную пипетку для переноса 19 микролитров мастер-смеси в каждую скважину 96-луночной пластины.
После переноса одного микролитра раствора высвобождения ДНК, содержащего ранее подготовленную ДНК комара, на пластину, запечатайте пластину уплотнением оптической ПЦР-пластины. Выполните ПЦР с соответствующими параметрами циклирования для создания профилей термического расплава в соответствии с параметрами, описанными в рукописи, затем изучите профили расплава, назначив контроль дикого типа эталонному кластеру. Отметьте различные кластеры соответствующими цветами на 96-луночном шаблоне.
Затем выберите людей с кривыми интереса и удалите выбранных особей из трубок обратного креста. Кровью питаются сделанные в ней самки, с последующим сбором G2As. В репрезентативном анализе показан анализ последовательности мутанта ZIP11 Aedes aegypti.
Электроферограмма от гетерозиготных мутантов Aedes aegypti ZIP11 указывала нуклеотидное положение, где произошел индель. Индель представлен сдвигом от одинарных к двойным пикам, поскольку полиморфные положения показывают оба нуклеотида одновременно. В конце прогона количество удаленных или вставленных пар оснований вычислялось путем подсчета одиночных пиков.
Комары, содержащие мутации в генах Aedes aegypti ZIP11 и myo-fem, были генотипированы и секвенированы с использованием анализа расплава с высоким разрешением HRMA. Флуоресцентные сигналы образцов были нормализованы до относительных значений от единицы к нулю. Кроме того, каждая кривая вычиталась из ссылки дикого типа и обозначала соответствующее увеличение.
Неудачное автоматическое назначение кластера отображается в репрезентативных результатах, где не было проведено надлежащего различия между группами. Далее каждый образец анализировали индивидуально и относили к правильным группам на основе сходства с эталонными образцами гетерозигот, гомозигот и трансгетерозигот. После выполнения HRMA секвенирование ДНК от мутировавших людей необходимо для анализа инделей и выявления других мутаций в целевой последовательности.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье подробно описан протокол экспресс-идентификации инделей, индуцированных системой CRISPR/Cas9, и отбора мутантных линий комаров Aedes aegypti с помощью анализа кривых плавления высокого разрешения. Этот метод эффективен и применим к различным организмам, что позволяет быстро выявлять мутантов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Генетика
- Молекулярная биология
- Энтомология
Теоретическая часть
- Технология CRISPR/Cas9 широко используется для редактирования генов.
- Эффективное выявление мутаций имеет решающее значение для генетических исследований.
- Анализ плавления с высоким разрешением (HRMA) представляет собой метод экспресс-детекции.
- Сложности при дизайне праймеров могут влиять на эффективность HRMA.
Цель исследования
- Предоставить протокол для идентификации мутаций, индуцированных системой CRISPR.
- Продемонстрировать применимость HRMA для различных организмов.
- Оптимизировать процесс отбора мутантных линий.
Используемые методы
- Приготовление мастер-микса для ПЦР.
- Использование отрицательных контролей (NTC) в 96-луночном планшете.
- Градиентная ПЦР для оптимизации условий.
- Анализ кривых плавления с высоким разрешением для обнаружения инделей.
Основные результаты
- Данный протокол позволяет быстро идентифицировать мутанты.
- HRMA может быть выполнен за несколько часов.
- Для достижения эффективности может потребоваться несколько раундов разработки праймеров.
- Метод универсален для различных видов.
Выводы
- Данный протокол повышает эффективность выявления мутантов.
- Он представляет собой ценный инструмент для генетических исследований комаров.
- Будущие исследования могут опираться на этот метод для более широкого применения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Быстрое обнаружение инделей, индуцированных системой CRISPR/Cas9, обеспечивает эффективную валидацию мишеней в исследованиях по контролю переносчиков, сокращая сроки функционального изучения генов. Анализ кривых плавления с высоким разрешением позволяет проводить масштабируемое генотипирование без забивания организмов, что облегчает последующие фенотипические анализы и генетические скрещивания. Данный подход повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска за счет количественного обнаружения мутаций в минимальных образцах тканей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы посредством быстрого обнаружения инделей после CRISPR-мутагенеза.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет идентификации мутантных аллелей без забивания организмов, что позволяет сохранить образцы для последующих анализов.
- Влияние на портфель разработок: ускоряет рабочие процессы валидации мишеней, позволяя быстрее определять приоритетные гены-мишени в системах, релевантных конкретным заболеваниям.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать нормализованные кривые плавления флуоресценции, что обеспечивает возможность количественного сравнения генотипов дикого типа и мутантов.
- Практическая ценность: совместимость с форматом 96-луночных планшетов поддерживает проведение скрининга отредактированных особей со средней пропускной способностью.
- Готовность анализа: генерирует различимые профили плавления для гетерозигот, гомозигот и трансгетерозигот, что позволяет надежно определять принадлежность к кластеру.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: позволяет проводить генотипирование с последующим фенотипированием или кормлением кровью, связывая генетическую модификацию с функциональными результатами в моделях заболеваний.
- Механистическое снижение рисков: облегчает характеристику инделей с помощью последующего секвенирования, что позволяет подтвердить целевые эффекты и выявить потенциальные нецелевые модификации.
- Поддержка доклинических моделей: обеспечивает создание мутантных линий Aedes aegypti, основного переносчика при изучении передачи арбовирусов.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод вписывается в континуум исследований от CRISPR-мутагенеза до идентификации перспективных соединений, обеспечивая этап генотипирования перед функциональной валидацией.
- Биология открытий: способствует проверке гипотез за счет быстрого выявления инделей, нарушающих функцию генов в целевых путях.
- Скрининг: обеспечивает стандартизацию анализа посредством нормализованного анализа кривых плавления и кластеризации на основе референсов.
- Аналитика: позволяет получать количественные сдвиги профилей плавления, которые коррелируют с размером инделя, что делает возможным сравнительный анализ различных образцов.
- Трансляционные исследования: связывают генетическую модификацию с фенотипической оценкой, позволяя использовать живые организмы после генотипирования.
- Корпоративное повторное использование: метод применим для различных организмов и генов, а адаптивность дизайна праймеров обеспечивает широкую применимость к различным мишеням.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней, предоставляя прямые доказательства результатов редактирования генов.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость за счет стандартизированных протоколов ПЦР и анализа кривых плавления со встроенным контролем.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала за счет сокращения времени и ресурсов, необходимых для скрининга мутантов.
- Влияние на портфель: Обеспечивает продвижение проектов с учетом рисков путем подтверждения наличия мутации перед инвестированием в фенотипические анализы.
Особенности реализации
- Требуется опыт в разработке и оптимизации праймеров, так как для эффективного проведения HRMA для некоторых генов может потребоваться несколько итераций дизайна.
- Зависимость от оборудования с точным контролем скорости повышения температуры и системой детекции флуоресценции для проведения анализа плавления с высоким разрешением.
- Необходима стандартизированная подготовка образцов с использованием тканей конечностей и реагентов для высвобождения ДНК для обеспечения стабильного качества исходного материала.
- Требуются референсные образцы дикого типа для точного распределения по кластерам и нормализации профилей плавления.
- Ограничение, связанное с необходимостью последующего секвенирования после HRMA для полной характеристики инделей и выявления дополнительных мутаций в целевой последовательности.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
A Gradient PCR Using Genomic DNA (gDNA) from a Single Individual
1:09
Preparation of Genomic DNA from Mosquito Legs
2:31
Perform PCR
3:35
Results: Detection of CRISPR/Cas9-Induced Indels and the Establishment of Mutant Lines in the Mosquito Aedes aegypti
5:02
Conclusion
