2,965 Views
•
08:24 min
•
September 27, 2021
DOI:
Этот протокол помогает установить связь между молекулярной силой и поведением клетки при качении, а также позволяет пространственно отображать и количественно оценивать адгезию качения на молекулярном уровне. Этот метод позволяет изучать отдельные события адгезии во время фактического скольжения клеток, что позволяет нам непосредственно измерять физиологическую силу молекулярной адгезии. Подготовка поверхности с использованием соответствующей концентрации и времени инкубации на каждом этапе имеет решающее значение для достижения высококачественной функционализации поверхности.
Качество биоконъюгации и надлежащие условия также имеют решающее значение. Визуальная демонстрация имеет решающее значение, чтобы помочь исследователям воспроизвести этот протокол. В частности, такие этапы, как сборка проточной камеры и постобработка изображений, значительно выиграют от визуальной демонстрации.
Начните с тонкого распределения небольшого количества эпоксидной смолы по обеим сторонам двусторонней ленты лезвием бритвы. С помощью лазера вырежьте ленту с эпоксидным покрытием для создания четырех каналов. Создайте проточную стружку, зажав эпоксидную ленту между затвором с четырьмя отверстиями и крышкой PEG.
Используя наконечник пипетки, примените мягкое давление по длине каналов, чтобы создать хорошее уплотнение, затем отверждайте эпоксидную смолу в течение как минимум одного часа. Выровняйте чип так, чтобы открытие каждого канала располагалось в центрах адаптера. Затем поместите две прозрачные акриловые прокладки поверх чипа.
Приложите сильное давление в середине блока и прикрутите винт на концах каждой распорки. Вкрутите входные отверстия в резьбовые отверстия с другой стороны кронштейна и следите за состоянием уплотнения через прозрачный акриловый блок. Пропустите 200 микролитров промывочного буфера в камеру для проверки утечки.
Если в канале образуются пузырьки, агрессивно протолкните дополнительные 200 микролитров промывочного буфера, чтобы удалить пузырьки. Добавьте 40 микролитров BSA в проточную камеру для предотвращения неспецифического связывания и инкубируйте в течение 10 минут в камере влажности. После инкубации добавьте 40 микролитров в Tween 20 в проточную камеру и снова инкубируйте в течение 10 минут, чтобы еще больше уменьшить неспецифическое связывание.
Затем промыть канал 200 микролитрами промывочного буфера, чтобы удалить все пассивационные агенты. Для функционализации поверхности камеры добавьте 40 микролитров Стрептавидина в проточную камеру и инкубируйте в течение 20 минут, затем промывайте камеру 200 микролитрами промывочного буфера. Теперь добавьте 40 микролитров гибридизированного белка G-TGT в проточную камеру и инкубируйте в течение 20 минут.
После промывки с помощью буфера для стирки добавьте 40 микролитров верхней нити белка G-TGT и инкубируйте в течение 20 минут, чтобы завершить любую негибридированную нижнюю прядь TGT на поверхности, а затем промыть буфером для стирки. Наконец, добавьте 40 микролитров P-selectin-Fc в проточную камеру и инкубируйте в течение 60 минут перед промывкой с помощью промывочного буфера. Наполните пятимиллилитровой стеклянный шприц скользящим буфером и постучите по бокам шприца, чтобы выбить и вытолкнуть пузырьки, когда они плывут к кончику.
После введения стерильной иглы в 200-миллиметровый кусок полиэтиленовой трубки подключите иглу к стеклянному шприцу. Закрепите шприц на шприцевом насосе и наклоните шприцевой насос так, чтобы сторона плунжера была приподнята, чтобы предотвратить попадание пузырьков воздуха в канал. Вставьте конец трубки во входное отверстие проточной камеры.
Вставьте один конец другого 200-миллиметрового куска полиэтиленовой трубки в выпускное отверстие и погрузите другой конец в стакан для отходов. Возьмите один-два миллилитра образца клеточной суспензии и центрифугу, чтобы гранулировать клетки. Извлеките среду и аккуратно повторно суспендируйте ячейки в 500 микролитрах буфера качения.
Осторожно отсоедините трубку от входных отверстий и выходного отверстия и пипетки 40 микролитров клеточной суспензии в проточной камере. Повторно подключите трубку, как описано ранее, гарантируя, что пузырьки не будут введены в канал потока. Начните эксперимент с клеточной прокаткой, запустив шприцевой насос с желаемой скоростью потока.
Наблюдайте за перемещением клеток с помощью микроскопа темного поля с объективом 10X. Как только эксперимент будет завершен, удалите клетки из канала, вливая буфер прокатки со скоростью 100 миллилитров в час, пока поверхность не станет свободной от клеток. Для визуализации локальных следов с помощью DNA-PAINT добавьте в канал 40 микролитров цепи тепловизора DNA-PAINT, приготовленной в буфере DNA-PAINT.
Выполнить флуоресцентную микроскопию полного внутреннего отражения с использованием условий, указанных в тексте рукописи. Локализуйте и визуализируйте изображения с сверхвысоким разрешением. Для визуализации длинных дорожек с помощью постоянной маркировки добавьте постоянную нить тепловизора и инкубируйте в течение 120 секунд в буфере T50M5.
Затем промыть канал, влив 200 микролитров промывочного буфера. Запишите изображение с выключенным лазером возбуждения, чтобы получить фоновый шум камеры. Изображение большой площади в виде сетки с помощью микроскопии TIRF.
Запрограммируйте микроскоп на сканирование на площади 400 на 50 изображений и разделение необработанных данных на отдельные файлы TIP, каждый из которых содержит максимум 10 000 изображений с помощью программы ImageJ. Сгладьте все изображения с помощью профиля освещения и используйте плагин MIST для сшивания изображений. Результат для характеристики биоконъюгации белка G ssDNA показал, что почти одно отношение белка G к ssDNA, где спектры буфера элюирования белка G малеимида и имидазола из ортогональной основы для подгонки к спектру продуктов биоконъюгации.
Нативный PAGE был использован для подтверждения биоконъюгации, показывающей ярко-зеленые полосы, совпадающие с мономерной полосой белка G, что указывает на успешную конъюгацию и хороший выход. Профиль освещения TIRF, введенный из одномодового волокна, как правило, ярче в середине поля зрения и тусклее по краям. Чтобы компенсировать неравномерное освещение и сгладить изображения для количественного анализа, профиль освещения определяли путем усреднения тысяч отдельных кадров.
Сглаженные изображения были получены путем вычитания шума камеры из профилей необработанного и освещения, а затем нормализации по профилю освещения. Необработанное сшивание показало четкие периодические узоры, соответствующие неисправленным изображениям, в то время как то же поле зрения, сшитое из сглаженных изображений, создавало плоский фон. Профиль нарастающего потока использовался для определения диапазона напряжения сдвига, приводящего к раскатке клеток и флуоресцентным дорожкам, под которыми можно было увидеть типичный след адгезии с одной ячейкой.
Показаны неоптимальные и оптимальные результаты флуоресцентных треков с недостаточной контрастностью, чрезмерной плотностью трека, оптимальной плотностью и контрастностью треков, а также дифракционной ограниченной и ДНК-PAINT визуализацией. время инкубации более 60 минут обеспечивает функционализацию поверхности, а правильная конструкция камеры предотвращает прохождение пузырьков, которые повреждают функционализированную поверхность. Эта процедура применима для количественного анализа молекулярной силы, участвующей в адгезии качения, и позволяет исследователям понять поведение качения различных типов клеток.
Этот метод позволяет исследователям исследовать новые вопросы, касающиеся событий быстрой адгезии, ведущих к дальнейшему продвижению исследований одной молекулы и механобиологии.
В этом протоколе представлены экспериментальные процедуры для выполнения анализа адгезионного следа для изображения событий адгезии во время быстрой клеточной скользящей адгезии.
Read Article
Цитировать это СТАТЬЯ
An, S. M., Kim, S. H., White, V. J., Yasunaga, A. B., McMahon, K. M., Murad, Y., Li, I. T. S. Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay. J. Vis. Exp. (175), e63013, doi:10.3791/63013 (2021).
Copy