Пробоподготовка липидным монослойным методом для электронно-кристаллографических исследований

На протяжении многих лет липидные монослои использовались в качестве поддерживающего слоя для содействия 2D-кристаллизации белков периферических мембран, а также растворимых белков. Этот метод также может быть применен к 2D-кристаллизации, как некоторые интегральные мембранные белки. Но требуется более обширное эмпирическое исследование для определения моющих и диализных условий, способствующих разделению на липидный монослой.

На границе раздела воздушной воды образуется липидный монослой, так что полярные головные группы липидов остаются гидратированными в водной фазе. А неполярные ацильные хвосты липидного перегородки с воздушной водной границей раздела, что нарушает поверхностное натяжение и выравнивает водную гладь. Характер заряда отличительных химических фрагментов групп головок липидов обеспечивает сродство к белкам в растворе.

Содействие связыванию, и в принципе формированию 2D-массива. Любые 2D-кристаллы, образованные на липидном монослое, могут быть легко перенесены в электронный микроскоп на ЭМ-сетке с углеродным покрытием, которая используется для подъема и поддержки кристаллической решетки на липидном слое. В этой рукописи мы описали липидную монослойную методологию для криогенной электронной микроскопии.

Липидный монослойный препарат. Препарат липидного запаса, готовят 0,01 мг на мл липидной смеси в объеме 9:1 к объему хлороформа, метанола. Используют 8,91 мл хлороформа и 0,99 мл метанола и 0,1 мл 10 мг на мл липидного раствора.

Подготовка тефлоновой пластины. Обшивайте тефлоновую пластину ультразвуком в метаноловой ванне в течение пяти минут. Промыть горячей водой в течение 15 минут, а затем промыть дистиллированной водой.

Высушите тефлоновую пластину в высушиваемом в течение 30 минут и держите ее под вакуумом до использования. Образование липидного монослоя на буферном резервуаре. Расчетное время работы составит полтора часа.

Поместите фильтровальную бумагу типа один в чашку Петри и разложите тефлоновый блок поверх фильтровальной бумаги. Заполните колодцы тефлоновой плиты 60 микролитами буфера. Осторожно добавляйте жидкую смесь поверх буферной поверхности капля за каплей.

В идеале один микролитр на каплю с помощью шприца Гамильтона. Смочите фильтровальную бумагу дистиллированной водой и сохраните влажность в чашке Петри. Инкубировать при комнатной температуре в течение 60 минут, хлороформ должен испариться и на поверхности буферов должен образоваться монослой липидов.

Нанесение ЭМ сетки на липидный монослой. Расчетное время работы полтора часа. Аккуратно поместите ЭМ-сетку с углеродным покрытием без свечения, выбрасывая углерод стороной вниз на поверхность каждого буферного резервуара.

Осторожно вводите белки в боковую инъекционную скважину, используйте конечные концентрации белка в колодце вокруг одного микромоляра. Инкубировать 60 минут при комнатной температуре. Осторожно вводят примерно от 20 до 30 микролитров буфера в отверстие для впрыска, чтобы поднять сетку над поверхностью тефлонового блока.

Это позволяет подобрать сетку парой пинцетов и поднять ее вертикально с капельки. Репрезентативные результаты. Липидный монослой, нанесенный на электромагнитную сетку, может быть визуализирован под просвечивающим электронным микроскопом без контрастного окрашивания.

Монослойное присутствие может быть распознано по контрастной разнице с областью без какого-либо образца на этом лучевом пути. Области, которые имеют липидное монослойное покрытие, имеют более низкую контрастность, чем те, которые не имеют покрытия. Поскольку электронный пучок через пустые дыры не имеет рассеяния, он показывает более яркое освещение.

В заключение, липидный монослойный метод предлагает возможность изучения белковых структур благодаря своей простоте. Это может обеспечить альтернативный подход для облегчения процесса 2D-кристаллизации.