Фоторазлагаемые гидрогелевые интерфейсы для скрининга, отбора и выделения бактерий
November 4th, 2021
Сообщается об использовании фоторазлагаемых гидрогелей для выделения бактериальных клеток с помощью инструмента для измерения света с высоким разрешением. Рассматриваются основные экспериментальные процедуры, результаты и преимущества процесса. Метод обеспечивает быструю и недорогую изоляцию целевых бактерий, проявляющих редкие или уникальные функции, из гетерогенных сообществ или популяций.
Этот протокол предназначен для быстрой изоляции клеток от экранирующих интерфейсов для геномной характеристики, и эта возможность важна, поскольку она может сочетать макроскопически наблюдаемые особенности клеток с геномной информацией. Целевые бактериальные клетки из экранирующих интерфейсов могут быть изолированы с высоким пространственным положением операционно простым способом с использованием этого метода. Гидрогели могут быть реализованы в других интерфейсах скрининга.
Материал гидрогеля может быть легко включен в микрофлюидные каналы для извлечения по требованию клеток из микрофлюидных устройств. Начните с прививки буфера сшивки с желаемой плотностью клеток. Готовят раствор предшественника гидрогеля в 0,5-миллилитровой микроцентрифужной трубке, добавляя 12,5 микролитра сшивающего буфера и 5,6 микролитра раствора диакрилата ПЭГ ОНБ.
И, наконец, добавьте в смесь 6,9 микролитров раствора тиола ПЭГ для предплечья. Для инкапсуляции клеток в растворе предшественника гидрогеля поместите тиолированные основания на чистую чашку Петри и расположите две распорки на двух противоположных сторонах крышки. Закрепите распорки на крышке основания, приклеив распорки к чашке Петри.
После добавления желаемого объема раствора предшественника на нереакционноспособную перфторалкилированную стеклянную горку поместите затвор на основание крышки и дайте гидрогелевому образованию завершиться при комнатной температуре в течение 25 минут. Как только гелеобразование будет завершено, аккуратно удалите перфторалкилированный стеклянный слайд. Поместите субстрат в чашку Петри размером 60 на 15 миллиметров, содержащую среду ATGN, дополненную антибиотиком.
Посейте 700 микролитров бактериальных клеточных суспензий с OD 600 0,1 над субстратом микролуночного массива и получите раствор предшественника гидрогеля, как было продемонстрировано ранее, используя 12,5 микролитра фосфатного буферного физиологического раствора ATGN рН восемь. Пипетка 12,5 микролитров раствора-предшественника на нереакционноспособном перфторалкилированном стеклянном предметном стекле и размещение двух 38-микрометровых стальных распорок на двух противоположных сторонах подложки микролуночного массива, иннокулированной ячейками. Затем переверните перфторалкилированный стеклянный слайд с каплей раствора предшественника и поместите каплю в середину субстрата микролунки.
Когда гидрогель образуется после инкубации в течение 25 минут при комнатной температуре, осторожно удалите стеклянный слайд из микролунтового субстрата и поместите субстрат в чашку Петри, содержащую среду ATGN, дополненную антибиотиком. Поместите образец в держатель PDMS и добавьте определенную среду поверх образца, чтобы предотвратить обезвоживание образца и обеспечить раствор носителя для высвобождаемых клеток. После того, как калибровочное зеркало находится в положении, отрегулируйте фокус микроскопа, чтобы получить четкое изображение колоний в массиве гидрогелей или микролунок, и осмотрите, чтобы определить колонии или колодцы, представляющие интерес.
Здесь спроектируйте световые паттерны, в то время как вид камеры показывает колонии внутри образца, чтобы проверить различные паттерны для извлечения клеток и сохранить определенный шаблон. Затем выберите раздел управления сеансом, добавьте сохраненную последовательность на вкладку с названием инструмента узорчатой подсветки. Выберите опцию стимуляции узора для просмотра и настройки нужного места экспозиции.
Затем отрегулируйте интенсивность света до 60% и время экспозиции до 40 секунд под вкладкой управления светодиодами и запустите процесс экспозиции. Мониторинг деградации гидрогеля в режиме реального времени и режиме Brightfield для обеспечения высвобождения клеток. Чтобы собрать высвобожденную клетку, измените фильтр микроскопа с Brightfield на TRITC, чтобы визуализировать открытую область образца невооруженным глазом.
Как только открытая область будет найдена, поместите конец трубки на облученное место, а затем измените фильтр микроскопа обратно на Brightfield, чтобы контролировать извлечение клеток в режиме реального времени. Используйте шприц, прикрепленный к другому концу трубки, чтобы осторожно извлечь 200 микролитров раствора, содержащего освобожденные клетки, и перенести раствор в 1,5-миллиметровую центрифужную трубку для анализа ДНК или покрытия. Различные микроструктуры ультрафиолетового света использовались для извлечения клеток из объемных гидрогелей, что повлияло на морфологию высвобождаемых клеток.
Воздействие ультрафиолета в кольцевой схеме привело к высвобождению всей колонии, инкапсулированной в защитный гидрогель ПЭГ. Напротив, подвергая часть или всю колонию воздействию ультрафиолетового света, клетки могут быть извлечены либо как агрегированные кластеры клеток, либо как свободные отдельные клетки. Плотность посева клеток и толщина гидрогеля важны для инкапсуляции клеток.
Более тонкие гидрогели приводили к микроколониям с минимальным перекрытием колоний, в то время как гидрогели с увеличенной толщиной приводили к перекрытию колоний, что могло привести к извлечению нескольких колоний. Перекрывающиеся колонии могут вызвать перекрестное загрязнение во время экстракции из-за двумерного характера светового рисунка. Когда верхняя колония становилась мишенью, нижележащая колония также извлекалась вместе с ней.
Также оценивалось влияние различных микрообразов ультрафиолетового света на жизнеспособность клеток. Когда микроколонии подвергались воздействию контролируемых доз ультрафиолетового света в круговом или перекрестном виде, восстановление клеток и чистота ДНК не были затронуты. Клетки были успешно извлечены из массивов микролунок с использованием этого подхода, что было очевидно из репрезентативных изображений конфокальной микроскопии, где при облучении в круговом и кольцевом паттерне клетки удалялись в соответствующем рисунке.
После извлечения из массивов микровелл оценивали жизнеспособность клеток и количество ДНК. Паттерны воздействия не повлияли ни на количество жизнеспособных клеток, ни на качество ДНК, что указывает на то, что жизнеспособные клетки бактерий могут быть избирательно извлечены из микролунок с минимальным повреждением, а их ДНК может быть выделена с высокой чистотой для последующего геномного анализа. Всегда проверяйте, что гидрогель сформировался, прежде чем удалять перфторалкилированный покров.
Точность и осторожность необходимы для размещения распорок для гидрогелевого осаждения и использования трубок для экстракции клеток.
Обзор
В данной статье рассматривается протокол изоляции бактериальных клеток с использованием фотодеградирующих гидрогеле и высокоточного светового паттерна. Метод позволяет быстро и экономично извлекать определенные бактерии из сложных сообществ, облегчая геномный анализ.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Клеточная биология
- Геномика
Предпосылки
- Изоляция конкретных бактериальных клеток крайне важна для геномной характеристики.
- Фотодеградирующие гидрогеле обеспечивают новый подход к инкапсуляции и извлечению клеток.
- Техника сочетает наблюдаемые характеристики клеток с геномными данными.
- Гидрогеле могут быть интегрированы в различные интерфейсы скрининга.
Цель исследования
- Разработать метод для быстрой изоляции целевых бактериальных клеток.
- Оценить эффективность световых паттернов в извлечении клеток.
- Оценить влияние толщины гидрогеле на жизнеспособность клеток и эффективность извлечения.
Используемые методы
- Приготовление растворов предшественников гидрогеле для инкапсуляции клеток.
- Использование инструментов светового паттерна для деградации гидрогеле и высвобождения клеток.
- Мониторинг извлечения клеток с помощью микроскопии.
- Оценка жизнеспособности клеток и качества ДНК после извлечения.
Основные результаты
- Клетки были успешно изолированы из массивов микроблюдцев с минимальным повреждением.
- Различные образцы УФ-света влияли на морфологию высвобожденных клеток.
- Толщина гидрогеле влияла на наложение колоний и результаты извлечения.
- Жизнеспособность клеток и чистота ДНК сохранялись во время процесса извлечения.
Выводы
- Метод позволяет избирательно извлекать жизнеспособные бактериальные клетки.
- Гидрогеле могут быть эффективно использованы в геномных исследованиях бактерий.
- Этот подход повышает эффективность изоляции клеток для последующих приложений.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
High-resolution photodegradable hydrogel interfaces enable precise screening and isolation of bacterial phenotypes, directly linking observable traits to downstream genomic analysis. This capability addresses a critical bottleneck in early discovery by allowing rapid, high-purity retrieval of rare or emergent bacterial strains from heterogeneous populations. The approach supports portfolio-wide efforts to de-risk target selection and accelerate functional validation in microbiology-driven R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct correlation of phenotypic screening with genotypic analysis for functional target validation.
- Supports biological de-risking by isolating rare or emergent bacterial phenotypes from complex libraries.
- Facilitates predictive confidence in target selection by ensuring high-purity retrieval of candidate strains.
Screening & Assay Development
- Prepares validated bacterial systems for downstream workflows through precise, contamination-minimized isolation.
- Standardizes assay outputs by enabling reproducible, spatially controlled cell retrieval.
- Enhances screening readiness and scalability for mutant libraries and consortia studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker discovery by enabling genomic characterization of phenotypically distinct isolates.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving cell viability and DNA integrity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing high-quality isolates for further functional studies.
Pipeline & Workflow Integration
This photodegradable hydrogel method integrates at the interface of phenotypic screening and genomic analysis, bridging early discovery and preclinical research stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling isolation of functionally relevant bacterial strains.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs through controlled cell encapsulation and release.
- Analytics: Provides high-purity samples for comparative genomic and phenotypic analyses.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by linking phenotype to genotype in isolated strains.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for diverse microbiology screening and isolation needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable cell isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling high-fidelity downstream analysis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of microbial targets and consortia.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel chemistry, microscopy, and light patterning instrumentation.
- Needs access to high-resolution light patterning tools and compatible microfluidic or microwell platforms.
- Demands cross-team standardization for hydrogel preparation and cell retrieval protocols.
- Adaptable to various bacterial models but sensitive to hydrogel thickness and colony overlap.
- Careful handling is essential to prevent cross-contamination and ensure high-purity isolation.
