Фоторазлагаемые гидрогелевые интерфейсы для скрининга, отбора и выделения бактерий
4 ноября 2021 г.
Сообщается об использовании фоторазлагаемых гидрогелей для выделения бактериальных клеток с помощью инструмента для измерения света с высоким разрешением. Рассматриваются основные экспериментальные процедуры, результаты и преимущества процесса. Метод обеспечивает быструю и недорогую изоляцию целевых бактерий, проявляющих редкие или уникальные функции, из гетерогенных сообществ или популяций.
Этот протокол предназначен для быстрой изоляции клеток от экранирующих интерфейсов для геномной характеристики, и эта возможность важна, поскольку она может сочетать макроскопически наблюдаемые особенности клеток с геномной информацией. Целевые бактериальные клетки из экранирующих интерфейсов могут быть изолированы с высоким пространственным положением операционно простым способом с использованием этого метода. Гидрогели могут быть реализованы в других интерфейсах скрининга.
Материал гидрогеля может быть легко включен в микрофлюидные каналы для извлечения по требованию клеток из микрофлюидных устройств. Начните с прививки буфера сшивки с желаемой плотностью клеток. Готовят раствор предшественника гидрогеля в 0,5-миллилитровой микроцентрифужной трубке, добавляя 12,5 микролитра сшивающего буфера и 5,6 микролитра раствора диакрилата ПЭГ ОНБ.
И, наконец, добавьте в смесь 6,9 микролитров раствора тиола ПЭГ для предплечья. Для инкапсуляции клеток в растворе предшественника гидрогеля поместите тиолированные основания на чистую чашку Петри и расположите две распорки на двух противоположных сторонах крышки. Закрепите распорки на крышке основания, приклеив распорки к чашке Петри.
После добавления желаемого объема раствора предшественника на нереакционноспособную перфторалкилированную стеклянную горку поместите затвор на основание крышки и дайте гидрогелевому образованию завершиться при комнатной температуре в течение 25 минут. Как только гелеобразование будет завершено, аккуратно удалите перфторалкилированный стеклянный слайд. Поместите субстрат в чашку Петри размером 60 на 15 миллиметров, содержащую среду ATGN, дополненную антибиотиком.
Посейте 700 микролитров бактериальных клеточных суспензий с OD 600 0,1 над субстратом микролуночного массива и получите раствор предшественника гидрогеля, как было продемонстрировано ранее, используя 12,5 микролитра фосфатного буферного физиологического раствора ATGN рН восемь. Пипетка 12,5 микролитров раствора-предшественника на нереакционноспособном перфторалкилированном стеклянном предметном стекле и размещение двух 38-микрометровых стальных распорок на двух противоположных сторонах подложки микролуночного массива, иннокулированной ячейками. Затем переверните перфторалкилированный стеклянный слайд с каплей раствора предшественника и поместите каплю в середину субстрата микролунки.
Когда гидрогель образуется после инкубации в течение 25 минут при комнатной температуре, осторожно удалите стеклянный слайд из микролунтового субстрата и поместите субстрат в чашку Петри, содержащую среду ATGN, дополненную антибиотиком. Поместите образец в держатель PDMS и добавьте определенную среду поверх образца, чтобы предотвратить обезвоживание образца и обеспечить раствор носителя для высвобождаемых клеток. После того, как калибровочное зеркало находится в положении, отрегулируйте фокус микроскопа, чтобы получить четкое изображение колоний в массиве гидрогелей или микролунок, и осмотрите, чтобы определить колонии или колодцы, представляющие интерес.
Здесь спроектируйте световые паттерны, в то время как вид камеры показывает колонии внутри образца, чтобы проверить различные паттерны для извлечения клеток и сохранить определенный шаблон. Затем выберите раздел управления сеансом, добавьте сохраненную последовательность на вкладку с названием инструмента узорчатой подсветки. Выберите опцию стимуляции узора для просмотра и настройки нужного места экспозиции.
Затем отрегулируйте интенсивность света до 60% и время экспозиции до 40 секунд под вкладкой управления светодиодами и запустите процесс экспозиции. Мониторинг деградации гидрогеля в режиме реального времени и режиме Brightfield для обеспечения высвобождения клеток. Чтобы собрать высвобожденную клетку, измените фильтр микроскопа с Brightfield на TRITC, чтобы визуализировать открытую область образца невооруженным глазом.
Как только открытая область будет найдена, поместите конец трубки на облученное место, а затем измените фильтр микроскопа обратно на Brightfield, чтобы контролировать извлечение клеток в режиме реального времени. Используйте шприц, прикрепленный к другому концу трубки, чтобы осторожно извлечь 200 микролитров раствора, содержащего освобожденные клетки, и перенести раствор в 1,5-миллиметровую центрифужную трубку для анализа ДНК или покрытия. Различные микроструктуры ультрафиолетового света использовались для извлечения клеток из объемных гидрогелей, что повлияло на морфологию высвобождаемых клеток.
Воздействие ультрафиолета в кольцевой схеме привело к высвобождению всей колонии, инкапсулированной в защитный гидрогель ПЭГ. Напротив, подвергая часть или всю колонию воздействию ультрафиолетового света, клетки могут быть извлечены либо как агрегированные кластеры клеток, либо как свободные отдельные клетки. Плотность посева клеток и толщина гидрогеля важны для инкапсуляции клеток.
Более тонкие гидрогели приводили к микроколониям с минимальным перекрытием колоний, в то время как гидрогели с увеличенной толщиной приводили к перекрытию колоний, что могло привести к извлечению нескольких колоний. Перекрывающиеся колонии могут вызвать перекрестное загрязнение во время экстракции из-за двумерного характера светового рисунка. Когда верхняя колония становилась мишенью, нижележащая колония также извлекалась вместе с ней.
Также оценивалось влияние различных микрообразов ультрафиолетового света на жизнеспособность клеток. Когда микроколонии подвергались воздействию контролируемых доз ультрафиолетового света в круговом или перекрестном виде, восстановление клеток и чистота ДНК не были затронуты. Клетки были успешно извлечены из массивов микролунок с использованием этого подхода, что было очевидно из репрезентативных изображений конфокальной микроскопии, где при облучении в круговом и кольцевом паттерне клетки удалялись в соответствующем рисунке.
После извлечения из массивов микровелл оценивали жизнеспособность клеток и количество ДНК. Паттерны воздействия не повлияли ни на количество жизнеспособных клеток, ни на качество ДНК, что указывает на то, что жизнеспособные клетки бактерий могут быть избирательно извлечены из микролунок с минимальным повреждением, а их ДНК может быть выделена с высокой чистотой для последующего геномного анализа. Всегда проверяйте, что гидрогель сформировался, прежде чем удалять перфторалкилированный покров.
Точность и осторожность необходимы для размещения распорок для гидрогелевого осаждения и использования трубок для экстракции клеток.
Обзор
В данной статье описывается протокол изоляции бактериальных клеток с использованием фотодеградируемых гидрогелей и светового структурирования с высоким разрешением. Этот метод позволяет быстро и экономично извлекать специфические бактерии из сложных сообществ, что облегчает проведение геномного анализа.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Клеточная биология
- Геномика
Теоретические основы
- Изоляция отдельных бактериальных клеток имеет решающее значение для геномной характеристики.
- Фотодеградируемые гидрогели обеспечивают новый подход к инкапсуляции и извлечению клеток.
- Данный метод объединяет наблюдаемые признаки клеток с геномными данными.
- Гидрогели могут быть интегрированы в различные интерфейсы скрининга.
Цель исследования
- Разработать метод быстрого выделения целевых бактериальных клеток.
- Оценить эффективность световых паттернов при экстракции клеток.
- Оценить влияние толщины гидрогеля на жизнеспособность клеток и эффективность их экстракции.
Используемые методы
- Приготовление растворов-прекурсоров гидрогеля для инкапсуляции клеток.
- Использование инструментов светового структурирования для деградации гидрогелей и высвобождения клеток.
- Мониторинг извлечения клеток с помощью микроскопии.
- Оценка жизнеспособности клеток и качества ДНК после извлечения.
Основные результаты
- Клетки были успешно изолированы из массивов микролунок с минимальными повреждениями.
- Различные паттерны УФ-излучения влияли на морфологию высвобожденных клеток.
- Толщина гидрогеля влияла на перекрывание колоний и результаты экстракции.
- Жизнеспособность клеток и чистота ДНК сохранялись в процессе экстракции.
Выводы
- Данный метод позволяет селективно извлекать жизнеспособные бактериальные клетки.
- Гидрогели могут быть эффективно использованы в геномных исследованиях бактерий.
- Этот подход повышает эффективность выделения клеток для последующего применения.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
Интерфейсы из фотодеградируемого гидрогеля высокого разрешения позволяют проводить точный скрининг и изоляцию бактериальных фенотипов, напрямую связывая наблюдаемые признаки с последующим геномным анализом. Эта возможность устраняет критический барьер на ранних этапах поиска, обеспечивая быстрое получение редких или возникающих бактериальных штаммов высокой степени чистоты из гетерогенных популяций. Данный подход поддерживает комплексные усилия по снижению рисков при выборе мишеней и ускорению функциональной валидации в рамках научно-исследовательских разработок в области микробиологии.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Обеспечивает прямую корреляцию фенотипического скрининга с генотипическим анализом для функциональной валидации мишени.
- Способствует биологическому снижению рисков путем изоляции редких или возникающих бактериальных фенотипов из сложных библиотек.
- Повышает прогностическую уверенность при выборе мишени, обеспечивая выделение кандидатных штаммов высокой степени чистоты.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных бактериальных систем для последующих этапов анализа путем точной изоляции с минимизацией загрязнения.
- Стандартизация результатов анализа за счет обеспечения воспроизводимого и пространственно контролируемого извлечения клеток.
- Повышение готовности к скринингу и масштабируемости исследований библиотек мутантов и консорциумов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует целям поиска трансляционных биомаркеров, обеспечивая геномную характеристику фенотипически различных изолятов.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа поиска до доклинической валидации за счет сохранения жизнеспособности клеток и целостности ДНК.
- Поддерживает принятие обоснованных решений по продвижению разработки, предоставляя высококачественные изоляты для последующих функциональных исследований.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод создания фотодеградируемого гидрогеля объединяет фенотипический скрининг и геномный анализ, связывая этапы раннего поиска и доклинических исследований.
- Открытия в биологии: способствует проверке гипотез и уточнению метаболических путей, позволяя изолировать функционально значимые штаммы бактерий.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты за счет контролируемого инкапсулирования и высвобождения клеток.
- Аналитика: предоставляет образцы высокой чистоты для сравнительного геномного и фенотипического анализа.
- Трансляционные исследования: облегчает сопоставление биомаркеров путем установления связи между фенотипом и генотипом в изолированных штаммах.
- Корпоративное использование: предлагает масштабируемую и адаптируемую платформу для различных целей микробиологического скрининга и изоляции.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность при валидации мишени.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые и масштабируемые рабочие процессы изоляции клеток.
- Стратегическая ценность: повышает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет обеспечения высокоточной последующей analyzing.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение микробных мишеней и консорциумов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области химии гидрогелей, микроскопии и использования оборудования для светового структурирования.
- Необходим доступ к инструментам светового структурирования высокого разрешения и совместимым микрофлюидным платформам или платформам с микролунками.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов приготовления гидрогелей и извлечения клеток.
- Метод применим к различным бактериальным моделям, однако чувствителен к толщине гидрогеля и перекрытию колоний.
- Необходима осторожность при работе для предотвращения перекрестного загрязнения и обеспечения выделения образцов высокой степени чистоты.
