Улучшение воспроизводимости для соответствия минимальной информации для исследований внеклеточных везикул 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis

Этот протокол был разработан для начинающих операторов NanoSight LM10. Следуя пошаговым инструкциям, можно получить точные и воспроизводимые результаты. Этот метод помогает обеспечить согласованные результаты в нескольких пробных запусках независимо от уровня квалификации пользователя.

Характеристика наночастиц, особенно количественная оценка, продолжает оставаться проблемой в области исследований внеклеточных пузырьков. Этот протокол позволяет проводить последовательный анализ размера и концентрации наночастиц в суспензии. Начните с очистки стеклянных поверхностей лазерного модуля с помощью хорошего качества очистителя линз и бумаги для линз.

Перед сборкой модуля убедитесь, что уплотнительное кольцо правильно установлено в канавке крышки проточной ячейки. Затем поместите крышку проточной ячейки на лазерный модуль, убедившись, что электрические контакты находятся в правильной ориентации. Затем поместите четыре подпружиненных винта большого пальца через пластину проточной ячейки и задействуйте резьбу лазерного модуля без затяжки по отдельности.

Оказывая равномерное давление на крышку проточной ячейки, равномерно затягивайте винты большого пальца попеременно по диагонали до плотного расположения. Промывайте два одномиллилитрового туберкулиновых шприца с адаптерами скользящего замка три раза одним миллилитром DPBS. Извлеките и выбросьте плунжер из первого туберкулинового шприца, прежде чем вставить шприц в оставшийся порт, чтобы он служил в качестве пустого разбавителя или резервуара для образцов.

Затем заполните второй шприц одним миллилитром DPBS и прикрепите его к входному порту крышки проточной ячейки. Держите лазерный модуль наклоненным с поднятым портом выходного шприца, чтобы воздух выдувался из камеры при медленном впрыскивании DPBS в лазерный модуль. Смывайте оставшуюся DPBS из лазерного модуля, впрыскивая один миллилитр воздуха во входной порт.

Повторите промывку дважды. После последнего смыва очистите лазерный модуль как можно полнее и загрузите модуль для фокусировки и позиционирования. Откройте программное обеспечение.

На вкладке захвата в левом верхнем углу нажмите кнопку Запустить камеру. Если фотокамера автоматически выключается через пять минут, нажмите кнопку Запустить камеру, чтобы перезапустить ее. На той же вкладке отрегулируйте уровень камеры до 14-16, чтобы осветлить лазерную линию и упростить идентификацию и фокусировку частиц.

Перемещая верхний ползунок с левой стороны головного убора внутрь или наружу, переместите изображение с камеры на окуляры. В поле зрения найдите область повышенной плотности, называемую отпечатком большого пальца и центром, и сфокусируйте отпечаток пальца вертикально. В поле зрения центрируйте лазерную линию, затем переместите верхний ползунок, чтобы направить свет на камеру, как это наблюдается на экране компьютера.

Изображение на экране компьютера является зеркальным отражением от вида в микроскопе окуляров. Отрегулируйте фокусировку, чтобы повысить резкость изображения отдельных движущихся частиц на экране с помощью ручки фокусировки. Чтобы загрузить образцы, вытяните один миллилитр образца в промытый один миллилитр туберкулиновый шприц и прикрепите шприц к входному отверстию крышки проточной ячейки.

Продолжайте продвигать плунжер до тех пор, пока жидкость не появится в открытом шприце, прикрепленном к выходному отверстию. Модуль должен быть наклонен, чтобы воздух мог быть выдуваемым из лазерного модуля. В представлении камеры переместите фокус вправо от лазерной линии в область равномерного числа частиц.

Отрегулируйте вертикальную ориентацию, чтобы центрировать горизонтальные полосы света и перефокусироваться до тех пор, пока не появится наибольшее количество частиц. Обеспечить сохранение положения фокуса последовательным для всех последующих мер. Отрегулируйте уровень камеры до такой степени, что темный информационный символ периодически мигает и выключается в правом верхнем углу обзора камеры.

Для анализа отслеживания наночастиц, или NTA, установите продолжительность 30 или 60 секунд, а количество видео — пять. Чтобы изменить существующее базовое имя файла, щелкните вкладку нового сайта хранения для созданных данных с новым именем файла. Затем установите флажок целевой температуры, чтобы ввести желаемую температуру, и нажмите на создать скрипт для повторного использования стандартного измерения.

После загрузки образца и готовности эксперимента к запуску щелкните Создать и запустить сценарий. Во всплывающем окне «Сведения о заданных деталях отчета» заполните поля необходимой информацией об операторе, образце и разбавителе. Когда все нужные поля будут заполнены, нажмите кнопку Параметры ОК, чтобы запустить сценарий.

Перед каждым захватом видео ищите подсказку для продвижения плунжера вручную. Введите приблизительно 0,05 миллилитра образца в лазерную камеру. Когда частицы остановятся, нажмите кнопку ОК. После завершения пятого видеозахвата вместе с полем процесса появится окно подтверждения настроек.

Поскольку кадры продвигаются вручную из нижней части видеоэкрана, обратите внимание на количество синих крестиков, образующих частицы на экране, и установите порог обнаружения для обработки образца. Подождите, пока видео будут автоматически обработаны в гистограмме результатов, прежде чем отобразится уведомление о завершении в диалоговом окне, затем нажмите OK. После появления окна параметров экспорта сохраните результаты, нажав кнопку Экспорт. Выделите все пять видеороликов захвата, перечисленных в текущем эксперименте.

Затем щелкните Обработать выбранные файлы и подождите, пока в поле процесса появится окно подтверждения настроек, чтобы изменить порог обнаружения, затем отрегулируйте порог обнаружения до нужного уровня, перейдите к настройкам и нажмите кнопку ОК. Видео будут обработаны автоматически в гистограмме результатов и появится диалоговое окно с уведомлением о завершении. Нажмите OK.In репрезентативного анализа, показаны результаты нанотрекингового анализа или NTA для образцов липосом и репрезентативного разбавителя DPBS. Отфильтрованные образцы имели средний диаметр частиц 108 нанометров и концентрацию в 7,4 раза больше 10 до восьмых частиц на миллилитр.

Напротив, нефильтрованные образцы имели средний диаметр частиц 159 нанометров и концентрацию в 7,6 раз от 10 до восьмой частицы на миллилитр. На комбинированных уровнях камеры, поскольку порог обнаружения был увеличен с двух до пяти, средний и режимный размер частиц показал значительное уменьшение размеров частиц отфильтрованных образцов. Концентрации частиц на комбинированных уровнях камеры были снижены по мере увеличения порога обнаружения.

Существенной разницы в концентрациях частиц между отфильтрованными и нефильтрованными образцами обнаружено не было. При комбинированных порогах обнаружения, когда уровень камеры увеличивался с 12 до 14, отмечалось уменьшение среднего и размеров частиц режима отфильтрованных образцов. Концентрации частиц при комбинированных порогах обнаружения увеличились по мере увеличения уровней камеры с 12 до 14.

Существенных различий между отфильтрованными и нефильтрованными образцами не наблюдалось. Шаги с 4.1 по 5.2 важны для поиска правильной области просмотра. Достижение последовательных результатов в ходе нескольких пробных запусков зависит от этого повторяемого навыка.

Динамическое рассеяние света часто используется в качестве компаньона к анализу отслеживания наночастиц в первую очередь для получения дзета-потенциала, который является поверхностным зарядом частиц. Для анализа наночастиц NTA продолжает оставаться очень ценным методом количественной оценки частиц, полезным для исследования внеклеточных пузырьков.