Использование кристаллической фиалки для улучшения визуального цитопатического эффекта для титрования вируса с использованием анализов TCID50
12 февраля 2022 г.
Этот протокол показывает точный и объективный подход к визуализации титрования вируса с использованием кристаллического фиолетового, сравнивая его с оптической микроскопией и иммуноцитохимическим окрашиванием.
Цель этого протокола состоит в том, чтобы произвести титрование вирусных запасов и визуализировать его с помощью кристаллического фиолетового окрашивания. Для этого будет продемонстрировано общее вирусное титрование с последующим окрашиванием. Это титрование будет проводиться в 96-луночной пластине в течение семи дней в шкафу биобезопасности в лаборатории уровня биобезопасности 2.
Для этого 96-луночную пластину предпочтительной клеточной линии засеять с использованием соответствующей среды и дать расти до слияния. Вирусный запас будет разбавляться с помощью десятикратных разведений, путем смешивания 900 микролитров среды и 100 микролитров вируса, или соответствующего разведения. Обязательно вихрь каждой трубки, чтобы обеспечить правильное смешивание среды и вируса и избежать ошибок на разведениях.
Напишите макет вашей тарелки в свинце, а также каждое разведение, чтобы помочь во время процесса заражения. Перед заражением мойтесь, используя 200 микролитров PBS. Добавьте 50 микролитров вашего инокулята в соответствующие скважины.
Затем инкубируйте при температуре 37 градусов по Цельсию в инкубаторе с 5% CO2 в течение семи дней. После семидневной инкубации промыть, используя 200 микролитров PBS. Зафиксируйте клетки, добавив 50 микролитров на лунку PFA при 4% в PBS и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.
После инкубации дважды промыть клетки 200 микролитрами PBS перед добавлением 50 микролитров на лунку кристалла фиолетового в воде и инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре. Наконец, аспирируйте кристалл фиолетового цвета из лунок и по желанию оставьте пластины сушиться на воздухе в течение двух-пяти минут при комнатной температуре или промыть его 200 микролитрами воды, чтобы удалить лишние пятна перед визуализацией. В результате после повторного окрашивания отрицательные клетки будут окрашиваться.
Положительные скважины будут очищены. Эта информация будет использоваться в одной из двух описанных формул для расчета вашего окончательного вирусного титра. Когда титр, полученный с каждым методом, сравнивали, он показал, что в моноцитохимии окрашивание может в некоторых случаях обнаруживать дополнительные положительные лунки по сравнению с кристаллической фиалкой, и что аналогичным образом оба метода окрашивания могут обнаруживать больше положительных ямок, чем визуальная оценка с помощью микроскопии.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе представлен точный метод визуализации титрации вирусов с помощью окрашивания кристаллическим фиолетовым. Этот метод сравнивается с данными оптической микроскопии и иммуноцитохимического окрашивания.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Вирусология
- Клеточная биология
- Лабораторные методы
Теоретическая часть
- Титрование вируса необходимо для количественного определения запасов вируса.
- Окрашивание кристаллическим фиолетовым обеспечивает визуальное представление о наличии вируса.
- Сравнительные методы включают оптическую микроскопию и иммуноцитохимическое окрашивание.
- Правильные методы разведения имеют решающее значение для получения точных результатов.
Цель исследования
- Для проведения титрования стокового раствора вируса.
- Для визуализации результатов титрования с помощью окрашивания кристаллическим фиолетовым.
- Для обеспечения точности методов количественного определения вируса.
Используемые методы
- Посев выбранной клеточной линии в 96-луночный планшет.
- Приготовление десятикратных разведений стокового раствора вируса.
- Перемешивание каждого разведения на вортексе для обеспечения однородности.
- Окрашивание кристаллическим фиолетовым после семидневного периода инкубации.
Основные результаты
- Успешная визуализация титров вируса с использованием кристаллического фиолетового.
- Сравнение с другими методами окрашивания продемонстрировало согласованность результатов.
- Достигнуто точное количественное определение вирусных стоков.
- Данный протокол представляет собой надежный метод для будущих исследований.
Выводы
- Окрашивание кристаллическим фиолетовым является эффективным методом визуализации титра вируса.
- Данный протокол повышает точность количественного определения вируса.
- Этот метод может быть использован в качестве основы для дальнейших исследований в различных областях применения.
Часто задаваемые вопросы
Промышленная значимость
Точное титрование вируса имеет решающее значение для скрининга противовирусных препаратов и разработки вакцин, поскольку противоречивые результаты при определении цитопатического действия (ЦПД) могут поставить под угрозу идентификацию перспективных соединений и принятие решений о целесообразности дальнейших исследований. Окрашивание кристаллическим фиолетовым представляет собой экономически эффективную и воспроизводимую альтернативу иммуноцитохимическому окрашиванию, что способствует стандартизации анализа и снижению вариабельности в рабочих процессах на ранних этапах поиска. Это повышает достоверность прогнозов при оценке эффективности противовирусных средств и позволяет проводить масштабируемый высокопроизводительный скрининг вирусов, вызывающих ЦПД, на основе определения 50% тканевой инфекционной дозы (TCID50).
Стратегические приложения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: обеспечивает объективную количественную оценку вирусной инфекционности, снижая зависимость от субъективной микроскопии и способствуя механистическому снижению рисков при определении мишеней для противовирусных препаратов.
- Практическая ценность: предоставляет быстрый и недорогой метод окрашивания, который повышает пропускную способность и воспроизводимость анализа при валидации перспективных противовирусных соединений.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получить четкие, количественно определяемые конечные точки для анализов TCID50, улучшая соотношение сигнал/шум в кампаниях по скринингу соединений.
- Практическая ценность: устраняет необходимость в дорогостоящих реагентах для ICC, снижая стоимость одного анализа и расширяя возможности применения на различных платформах для поиска противовирусных препаратов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: обеспечивает стабильное измерение вирусного титра в различных исследованиях, что способствует надежному моделированию зависимости «доза-эффект» в исследованиях доклинической эффективности.
- Практическая ценность: облегчает стандартизацию приготовления вирусных стоков между лабораториями, снижая межэкспериментальную вариабельность в исследованиях для подачи заявки на регистрацию нового лекарственного препарата (IND).
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод является частью общего процесса поиска противовирусных средств — от первоначального подтверждения хитов до оптимизации лидов, при которой точное титрование вируса позволяет определить взаимосвязь «структура — активность» и профили резистентности.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез путем предоставления воспроизводимых моделей вирусного заражения для изучения механизмов действия.
- Скрининг: обеспечивает стандартизированные, количественно определяемые результаты, необходимые для перехода от поиска хитов к оптимизации лидов в каскадах противовирусного скрининга.
- Аналитика: позволяет точно рассчитывать значения TCID50, что дает возможность корректно сравнивать эффективность соединений при различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность между противовирусным скринингом in vitro и моделями заражения in vivo за счет согласованного количественного определения вирусных стоков.
- Корпоративное использование: представляет собой масштабируемую и недорогую методику, применимую для множества вирусных мишеней и терапевтических областей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов противовирусной эффективности за счет сокращения количества ложноотрицательных результатов при визуальной оценке ЦПЭ.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и масштабируемость анализов TCID50 благодаря упрощенному стандартизированному окрашиванию.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала в программах по разработке противовирусных препаратов за счет снижения затрат на анализ без потери качества данных.
- Влияние на портфель: Поддерживает принятие решений о продвижении проектов с учетом рисков, предоставляя надежные данные о вирусном титре для критериев принятия решения «продолжать/прекратить» (go/no-go).
Особенности реализации
- Требуется базовое обучение в области вирусологии и владение методами асептики для безопасной работы с вирусами в условиях BSL-2.
- Требуется стандартное лабораторное оборудование, включая инкубаторы, центрифуги и планшетные ридеры для возможного количественного анализа.
- Необходимо согласование продолжительности окрашивания и протоколов промывки между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости результатов между лабораториями.
- Применимо к адгезивным клеточным линиям, поддерживающим формирование ЦПЭ; может потребоваться оптимизация для неадгезивных клеток или вирусов, не вызывающих ЦПЭ.
- Метод ограничен вирусами, вызывающими обнаруживаемый цитопатический эффект; без модификации не подходит для нецитопатических вирусов или моделей персистирующей инфекции.
