Внутриберибиальная инъекция клеток остеосаркомы для создания ортотопических моделей мышиной остеосаркомы и метастазов в легкие

Этот протокол описывает метод генерации мышиных моделей с первичной остеосаркомой и поражениями легочных метастазов. При внутриберибной инъекции клеток остеосаркомы эта модель лучше всего имитирует клинические характеристики развития опухолевой остеосаркомы. Точное количество клеток остеосаркомы вводится непосредственно в большеберцовую кость с помощью микрообъемного шприца, что позволяет обеспечить одинаковую скорость образования опухоли и объемы опухоли.

В день инъекции клеток остеосаркомы дважды промывайте клетки PBS. Трипсинизируют клетки 1,5 миллилитрами 0,25% трипсина в течение трех минут. Затем добавляют шесть миллилитров 10%-ной сывороточносодержащей MEM среды.

Соберите клетки в 15-миллилитровую центрифужную трубку. Аспирируйте 20 микролитров клеточной суспензии в камеру счетной пластины ячейки и рассчитывайте концентрацию клеток с помощью автоматического счетчика клеток. Центрифугируйте клетки в 800 раз г в течение пяти минут при комнатной температуре.

Аспирируйте супернатант пипеткой, повторно суспендируйте клеточную гранулу в матрицу базальной мембраны 8,5 миллиграмм на миллилитр и поместите их на лед. Поместите мышь в положение лежа на спине. Удерживайте лодыжку мыши большим и указательным пальцами и дезинфицируйте место инъекции большеберцовой кости 70% этаноловым тампоном.

Поверните голеностопный сустав каждой мыши наружу, чтобы переместить большеберцовую и малоберцовую кости, и согните коленный сустав в подходящее положение, пока проксимальное плато большеберцовой кости не будет видно через кожу. Прикрепите иглу к одномилитровому шприцу и направьте кончик иглы к месту инъекции, параллельно оси большеберцовой кости. Чрескожно вставьте иглу, чтобы просверлить отверстие через платформу большеберцовой кости к дистальному концу большеберцовой кости.

Загрузите клеточную суспензию остеосаркомы, предварительно помещенную на лед, в микрообъемный шприц и замените одномиллилитровой шприц в голени на микрообъемный шприц с клеточной нагрузкой остеосаркомы. Медленно вводите примерно 10 микролитров клеточной суспензии остеосаркомы в большеберцовую кость каждой атимической мыши, не оказывая большого давления. Затем извлеките микрообъемный шприц из места инъекции и надавите на место ватным тампоном примерно на 30 секунд.

Поместите мышь обратно в чистую клетку и наблюдайте за ее восстановлением в течение 10 минут. На этом рисунке изображена модель мыши с ортотопической остеосаркомой, развившейся в результате интратибиальной инъекции клеток остеосаркомы и ее изолированной формы. Постепенное увеличение объема опухоли наблюдается каждую неделю.

Рентгеновские снимки, полученные с первой по шестую неделю после инъекции клеток остеосаркомы, меченных люциферазой, показали постепенное увеличение объема. Кроме того, изображение, полученное после инъекции в большеберцовую кость мыши, показало рост ортотопической остеосаркомы in vivo. Легочное метастазирование, вызванное внутрибереговой инъекцией клеток остеосаркомы, было успешно отслежено in vivo с использованием биолюминесцентной живой системы визуализации.

Наблюдение под стереомикроскопом выявило метастатические колонии в изолированных тканях легких. Окрашивание HE на парафиновых внедренных легочных тканях показало метастатические поражения. Игла должна быть чрескожно вставлена в суставную капсулу через связку надколенника, чтобы просверлить отверстие через платформу большеберцовой кости к цифровой голени путем вращения шприца.