Внутриберибиальная инъекция клеток остеосаркомы для создания ортотопических моделей мышиной остеосаркомы и метастазов в легкие
28 октября 2021 г.
Настоящий протокол описывает интратибию остеосаркомы для генерации мышиных моделей, несущих ортотопическую остеосаркому и поражения легочными метастазами.
Этот протокол описывает метод генерации мышиных моделей с первичной остеосаркомой и поражениями легочных метастазов. При внутриберибной инъекции клеток остеосаркомы эта модель лучше всего имитирует клинические характеристики развития опухолевой остеосаркомы. Точное количество клеток остеосаркомы вводится непосредственно в большеберцовую кость с помощью микрообъемного шприца, что позволяет обеспечить одинаковую скорость образования опухоли и объемы опухоли.
В день инъекции клеток остеосаркомы дважды промывайте клетки PBS. Трипсинизируют клетки 1,5 миллилитрами 0,25% трипсина в течение трех минут. Затем добавляют шесть миллилитров 10%-ной сывороточносодержащей MEM среды.
Соберите клетки в 15-миллилитровую центрифужную трубку. Аспирируйте 20 микролитров клеточной суспензии в камеру счетной пластины ячейки и рассчитывайте концентрацию клеток с помощью автоматического счетчика клеток. Центрифугируйте клетки в 800 раз г в течение пяти минут при комнатной температуре.
Аспирируйте супернатант пипеткой, повторно суспендируйте клеточную гранулу в матрицу базальной мембраны 8,5 миллиграмм на миллилитр и поместите их на лед. Поместите мышь в положение лежа на спине. Удерживайте лодыжку мыши большим и указательным пальцами и дезинфицируйте место инъекции большеберцовой кости 70% этаноловым тампоном.
Поверните голеностопный сустав каждой мыши наружу, чтобы переместить большеберцовую и малоберцовую кости, и согните коленный сустав в подходящее положение, пока проксимальное плато большеберцовой кости не будет видно через кожу. Прикрепите иглу к одномилитровому шприцу и направьте кончик иглы к месту инъекции, параллельно оси большеберцовой кости. Чрескожно вставьте иглу, чтобы просверлить отверстие через платформу большеберцовой кости к дистальному концу большеберцовой кости.
Загрузите клеточную суспензию остеосаркомы, предварительно помещенную на лед, в микрообъемный шприц и замените одномиллилитровой шприц в голени на микрообъемный шприц с клеточной нагрузкой остеосаркомы. Медленно вводите примерно 10 микролитров клеточной суспензии остеосаркомы в большеберцовую кость каждой атимической мыши, не оказывая большого давления. Затем извлеките микрообъемный шприц из места инъекции и надавите на место ватным тампоном примерно на 30 секунд.
Поместите мышь обратно в чистую клетку и наблюдайте за ее восстановлением в течение 10 минут. На этом рисунке изображена модель мыши с ортотопической остеосаркомой, развившейся в результате интратибиальной инъекции клеток остеосаркомы и ее изолированной формы. Постепенное увеличение объема опухоли наблюдается каждую неделю.
Рентгеновские снимки, полученные с первой по шестую неделю после инъекции клеток остеосаркомы, меченных люциферазой, показали постепенное увеличение объема. Кроме того, изображение, полученное после инъекции в большеберцовую кость мыши, показало рост ортотопической остеосаркомы in vivo. Легочное метастазирование, вызванное внутрибереговой инъекцией клеток остеосаркомы, было успешно отслежено in vivo с использованием биолюминесцентной живой системы визуализации.
Наблюдение под стереомикроскопом выявило метастатические колонии в изолированных тканях легких. Окрашивание HE на парафиновых внедренных легочных тканях показало метастатические поражения. Игла должна быть чрескожно вставлена в суставную капсулу через связку надколенника, чтобы просверлить отверстие через платформу большеберцовой кости к цифровой голени путем вращения шприца.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается методика создания моделей мышей с первичной остеосаркомой и очагами метастазов в легких. Благодаря внутрибольшеберцовому введению клеток остеосаркомы данная модель наилучшим образом имитирует клинические характеристики развития опухолевой остеосаркомы.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Онкология
- Модели на животных
Теоретическая база
- Остеосаркома представляет собой распространенный вид рака костей у детей и подростков.
- Понимание механизмов ее метастазирования имеет решающее значение для разработки эффективных методов лечения.
- Животные модели необходимы для изучения поведения опухоли и ответов на терапию.
- Интратибиальная инъекция позволяет изучать локальный рост опухоли и метастазирование.
Цель исследования
- Создать надежную модель остеосаркомы на мышах для проведения исследований.
- Изучить характеристики первичных опухолей и их метастазов.
- Обеспечить возможность тестирования терапевтических стратегий в контролируемых условиях.
Используемые методы
- Интратибиальное введение клеток остеосаркомы с помощью микрообъемного шприца.
- Промывка клеток PBS перед инъекцией.
- Трипсинизация клеток для подготовки к введению.
- Мониторинг скорости образования и объема опухолей после инъекции.
Основные результаты
- Во всех моделях были достигнуты стабильные показатели скорости формирования опухоли.
- Наблюдались идентичные объемы опухолей, что свидетельствует о воспроизводимости результатов.
- В моделях было успешно установлено развитие легочных метастазов.
- Модель отражает клинические характеристики прогрессирования остеосаркомы.
Выводы
- Метод внутрибольцевых инъекций эффективен для моделирования остеосаркомы.
- Данная модель может быть использована в будущих терапевтических исследованиях.
- Полученные результаты способствуют пониманию биологии и методов лечения остеосаркомы.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Ортотопические модели остеосаркомы, созданные путем внутрибольберцового введения, обеспечивают воспроизводимое формирование опухоли и развитие легочных метастазов, предоставляя клинически релевантную систему для валидации мишеней и тестирования терапевтической эффективности. Данный подход способствует снижению механистических рисков за счет воспроизведения прогрессирования заболевания человека у иммунодефицитных мышей, что позволяет осуществлять лонгитюдный мониторинг первичного очага и метастатической нагрузки. Чувствительность этой модели к биолюминесцентной и рентгеновской визуализации обеспечивает количественные показатели, необходимые для принятия решений о дальнейшем развитии (go/no-go) на доклинических этапах разработки онкологических препаратов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы в биологически релевантной системе, имитирующей канцерогенез остеосаркомы и метастазирование в легкие у человека.
- Практическая ценность: обеспечивает стабильную частоту приживления опухоли и измеримую кинетику роста для надежного изучения взаимодействия с мишенью и модуляции сигнальных путей.
- Прогностическая ценность: способствует выбору доклинической модели за счет отражения клинических паттернов метастазирования, что повышает уверенность при определении приоритетности мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Создание стандартизированных ортотопических опухолей, пригодных для подготовки валидированных биологических систем, используемых в последующем скрининге лекарственных препаратов.
- Практическая ценность: Обеспечение воспроизводимого количественного определения объема опухоли и метастатической нагрузки с помощью визуализации, что способствует стандартизации анализа в различных исследованиях.
- Масштабируемость: Короткий период инкубации и быстрый рост позволяют своевременно оценивать соединения и повторно использовать платформу в кампаниях по поиску ведущих структур.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Отражает прогрессирование остеосаркомы в клинике, где доминирующим летальным фенотипом является метастазирование в легкие, что соответствует исходам у пациентов.
- Снижение механистических рисков: Позволяет оценивать взаимодействия в микроокружении опухоли и факторы, стимулирующие метастазирование, в физиологически контекстуализированной модели.
- Терапевтическая оценка: Облегчает тестирование эффективности потенциальных препаратов in vivo, при этом первичная опухоль и очаги метастазов могут быть изолированы для проведения анализа конечных точек.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данная модель вписывается в континуум разработки лекарственных средств — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до изучения доклинической эффективности, что особенно актуально для костнотропных и модулирующих метастазирование агентов.
- Биологические исследования: обеспечивает проверку гипотез о драйверах остеосаркомы и супрессорах метастазирования с использованием ортотопической системы на иммунодефицитных организмах-хозяевах.
- Скрининг: предоставляет количественные данные на основе визуализации (биолюминесценция, рентгеновское излучение), что позволяет сравнивать эффекты терапии на рост и распространение опухоли.
- Аналитика: обеспечивает продольные количественные показатели опухолевой нагрузки и частоты метастазирования, что способствует кросс-функциональной интерпретации данных.
- Трансляционные исследования: связывает ранние выводы о механизмах развития болезни с доклинической валидацией посредством клинически значимых паттернов метастазирования.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для онкологических программ по изучению остеосаркомы, сокращая необходимость повторной разработки моделей для разных проектов.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования за счет моделирования всего спектра прогрессирования остеосаркомы, включая метастатическое распространение в легкие.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимость за счет стандартизированной подготовки клеток, техники инъекции и мониторинга с помощью методов визуализации.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, позволяя на ранних этапах выявлять неэффективных кандидатов с помощью конечных точек, чувствительных к метастазированию.
- Влияние на портфель: Обосновывает решения о дальнейшем продвижении препаратов с учетом рисков, предоставляя понимание механизмов взаимодействия опухоли и стромы, а также метастатического потенциала.
Особенности реализации
- Требуется опыт в методах ортотопического введения и работе с моделями мышей с иммунодефицитом.
- Зависимость от наличия микрообъемных шприцев, матрикса базальной мембраны, а также систем биолюминесцентной и рентгеновской визуализации.
- Необходима межгрупповая стандартизация подготовки клеток, объема инъекции и критериев конечной точки для получения воспроизводимых результатов.
- Адаптация к альтернативным клеточным линиям остеосаркомы может потребовать оптимизации концентрации матрикса и объема инъекции.
- Практические ограничения включают вариабельность модели в зависимости от точности инъекции и необходимость соблюдения критериев размера опухоли в соответствии с требованиями IACUC.
