Живая визуализация окислительно-восстановительного состояния митохондриального глутатиона в первичных нейронах с использованием ратиометрического индикатора
20 октября 2021 г.
В этой статье описывается протокол для определения различий в базальном окислительно-восстановительном состоянии и окислительно-восстановительных реакциях на острые возмущения в первичных нейронах гиппокампа и коры с помощью конфокальной живой микроскопии. Протокол может быть применен к другим типам клеток и микроскопам с минимальными модификациями.
Этот метод позволяет исследовать, как митохондриальное окислительно-восстановительное состояние влияет в патофизиологических условиях. Он также может быть использован для оценки эффективности стратегий лечения, направленных на защиту митохондрий. Основным преимуществом данной методики является то, что она позволяет органу и специфическо оценивать динамические и прослеживающие изменения окислительно-восстановительного состояния митохондрий в режиме реального времени.
Этот способ можно комбинировать с дополнительными показателями для одновременной регистрации, например, потенциала митохондриальной мембраны или концентраций кальция в дополнение к окислительно-восстановительному состоянию. Этот протокол может быть применен к клеткам культивирования, тканевым эксплантам и культурам срезов. Начните с оптимизации настроек сканирующего конфокального микроскопа.
Для этого установите детектор на 12 бит или 16 бит, активируйте режим последовательного сканирования и добавьте вторую последовательность/трек. Для обоих каналов выберите таблицу подстановки псевдоцветов, которая показывает переэкспонированные и недоэкспонированные пиксели, а затем выберите объект, подходящий для интересующего объекта. Установите крышку с ячейками в камеру визуализации.
Добавьте один миллилитр буфера визуализации и поместите камеру на микроскоп. Используйте окуляр и пропускаемый свет, чтобы сфокусировать клетки. Записывайте изображения с различными форматами пикселей и размерами точечных отверстий.
Затем записывайте изображения с различной интенсивностью лазера и соответственно регулируйте коэффициент усиления и порог детектора. Наконец, записывайте изображения с разной скоростью сканирования и разным количеством средних кадров. Для изображения в реальном времени установите интервал замедленной съемки равным 30 секундам и продолжительность 25 минут.
Затем установите клетки, поместите камеру на микроскоп и сфокусируйте клетки, как было продемонстрировано ранее. Переключитесь в режим сканирования и используйте 488-нанометровый канал в режиме реального времени, чтобы сфокусировать и найти ячейки для визуализации. При необходимости, чтобы увеличить количество записываемых ячеек за прогон, используйте многоточечную функцию для отображения двух-трех полей зрения на облицовочный лист.
Начните сбор таймлапса и запишите пять изображений в качестве двухминутной базовой записи. Добавьте 500 микролитров раствора 3X NMDA в камеру для достижения конечной концентрации 30 микромоляров и запишите дополнительные 20 изображений в качестве 10-минутного NMDA-ответа. Затем добавьте 500 микролитров раствора 4X DA в камеру и запишите еще шесть изображений.
Аспирируйте буфер из камеры визуализации и замените его одним миллилитром раствора DTT. После записи еще 10 изображений завершите запись и сохраните серию изображений. Для импорта данных в программное обеспечение для анализа изображений нажмите на плагины, выберите биоформаты, а затем импортер биоформатов.
В диалоговом окне выберите гиперстек в стеке представлений, установите цветовой режим по умолчанию и выберите автоматическое масштабирование. Измените формат изображения на 32 бита, щелкнув по изображению, выбрав тип, а затем из параметров выберите 32 бита. Чтобы разделить цветовые каналы на отдельные окна, нажмите на изображение, перейдите к цвету и выберите разделенные каналы.
Отрегулируйте порог, чтобы выбрать митохондрии для анализа, нажав на изображение, выбрав корректировку и порог. В диалоговом окне выберите по умолчанию красный темный фон и гистограмму стека. Когда выбранные пикселы станут красными, нажмите «Применить».
Затем установите пиксели фона для обработки NAN всех изображений и выполните ту же процедуру для второго канала. Для визуализации соотношения 405 к 488 нанометрам создайте изображение соотношения, нажав на калькулятор процесса и изображения. В диалоговом окне выберите первый канал в изображении один деление в операционном канале два в изображении два.
Затем выберите создать новое окно и обработать все изображения. Измените таблицу подстановки изображения с соотношением цвета на псевдоцвет, щелкнув изображение, выбрав таблицы подстановки, а затем выстрелите. Для анализа изображения нарисуйте ROI вокруг отдельных клеток или митохондрий на изображении соотношения.
Чтобы добавить ROI в менеджер ROI, перейдите к анализу, нажмите на инструменты, выберите менеджер ROI, нажмите «Добавить» и выберите «Показать все». Чтобы измерить соотношение от 405 до 488 нанометров отдельных ячеек, нажмите на менеджер ROI, выберите все ROI, нажав Control A, перейдите к дополнительному и выберите многомерный. В диалоговом окне выберите Измерить все фрагменты и по одной строке на фрагмент.
После экспорта измерений в программное обеспечение для работы с электронными таблицами выберите 405-нанометровое изображение, измерьте интенсивность всех ROI и снова экспортируйте измерения в программное обеспечение для работы с электронными таблицами. Аналогичным образом измерьте интенсивность ROI 488-нанометрового изображения. Чтобы сохранить окупаемость инвестиций для дальнейшего использования, выберите все окупаемости инвестиций, нажав клавишу Control A, перейдите к разделу «Дополнительно» и нажмите кнопку «Сохранить».
Эти репрезентативные снимки из записи таймлапса показывают изображения соотношения нейронов до и после nmDA лечения и после максимальной / минимальной калибровки с DA и DTT. Обработка нейронов 30 микромолярной NMDA-индуцированной окислением митохондрий в течение нескольких минут. Анализ отдельных флуоресцентных каналов показал, что NMDA-индуцированный митохондриальный ацидоз вызывал падение флуоресценции GFP при возбуждении как на 405, так и на 488 нанометров.
В контрольном эксперименте предварительная обработка DA исключала дальнейшее окисление митохондрий NMDA. И, соответственно, соотношение 405 к 488 не изменилось, несмотря на значительное гашение окислительно-чувствительной интенсивности флуоресценции GFP2. Этот эксперимент подтвердил, что соотношение 405 к 488 нанометрам не зависит от изменений рН.
В отдельном эксперименте митохондриальный мембранный потенциал, окислительно-восстановительное состояние и морфология оценивались параллельно. Лечение нейронов с 60 микромолярной NMDA привело к потере сигнала тетраметилродамина или TMRE и увеличению соотношения GFP от 405 до 488 нанометров rho с последующим некоторым отсроченным округлением митохондрий. Когда вы начинаете использовать этот метод, очень важно уделить время тщательной оптимизации микроскопических настроек.
Это поможет сохранить нейроны здоровыми во время ваших экспериментов. Также очень важно всегда соблюдать правила безопасности лазера. Убедитесь, что вы не подвергаетесь воздействию лазерного излучения, когда вы добавляете лекарства для подделки во время живых записей.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол использования конфокальной микроскопии живых клеток для оценки окислительно-восстановительного состояния и ответов на острые воздействия в первичных нейронах гиппокампа и коры головного мозга. Особое внимание уделяется оценке окислительно-восстановительного состояния митохондрий в режиме реального времени при различных условиях, что подчеркивает возможности применения данного метода для анализа стратегий лечения, направленных на митохондриальную защиту.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Митохондриальная динамика
Теоретические основы
- Исследование окислительно-восстановительного состояния митохондрий в патофизиологических условиях.
- Фокус на динамических изменениях редокс-статуса в режиме реального времени.
- Сочетание визуализации с другими показателями, такими как митохондриальный мембранный потенциал.
- Применимость к различным типам клеток и установкам для микроскопии.
Цель исследования
- Разработать методику мониторинга редокс-состояния митохондрий.
- Оценить влияние NMDA и других видов воздействия на жизнеспособность нейронов.
- Подтвердить эффективность протокола в различных экспериментальных условиях.
Используемые методы
- В качестве платформы для визуализации использовалась конфокальная микроскопия живых клеток.
- Биологической моделью служили первичные нейроны гиппокампа и коры головного мозга.
- Основное внимание было уделено мониторингу флуоресцентных индикаторов в режиме реального времени.
- Проведены эксперименты по изучению митохондриальных ответов, индуцированных NMDA, и последующей терапии.
- Параметры сканирования были оптимизированы для поддержания жизнеспособности нейронов во время визуализации.
Основные результаты
- Продемонстрировано окисление митохондрий, индуцированное NMDA, в течение нескольких минут.
- Показаны изменения соотношения флуоресценции, указывающие на окислительно-восстановительные сдвиги.
- Подтверждено, что воздействие препаратов может предотвратить окисление и поддерживать редокс-баланс.
- Подчеркнута важность оптимизации параметров визуализации для получения достоверных результатов.
Выводы
- Данное исследование устанавливает надежный протокол для оценки окислительно-восстановительных состояний митохондрий в нейронах.
- Способствует пониманию митохондриальных ответов в условиях стресса и при проведении терапии.
- Вносит вклад в понимание механизмов функционирования нейронов и поиск потенциальных терапевтических стратегий.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Оценка окислительно-восстановительного потенциала глутатиона в митохондриях первичных нейронов обеспечивает механистический считываемый показатель окислительного стресса в моделях нейродегенеративных заболеваний. Данный метод ратиометрической визуализации позволяет проводить количественную оценку антиоксидантной способности митохондрий в режиме реального времени, что способствует валидации мишеней и скринингу перспективных соединений для разработки нейропротекторных стратегий. Метод облегчает многопараметрический анализ за счет одновременной визуализации редокс-статуса и потенциала митохондриальной мембраны, повышая достоверность прогнозов в рабочих процессах доклинической оценки рисков.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет изучать гомеостаз редокс-состояния глутатиона в митохондриях в качестве терапевтической мишени в путях окислительного стресса.
- Операционная ценность: обеспечивает количественные рациометрические показатели, которые снижают вариабельность в анализах взаимодействия с мишенью.
- Прогностическая ценность: способствует биологическому снижению рисков путем установления связи между редокс-модуляцией и жизнеспособностью нейронов в патофизиологических условиях.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать данные о зависимости «доза-ответ» для соединений, влияющих на окислительно-восстановительное состояние митохондрий, используя NMDA в качестве стандартизированного окислительного стресса.
- Практическая ценность: Обеспечивает возможность калибровки с помощью диамида и DTT для установления динамического диапазона, что гарантирует воспроизводимость анализа между разными сериями экспериментов.
- Масштабируемость: Совместимость с многоточечной визуализацией для повышения пропускной способности при скрининге библиотек соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: позволяет оценивать окислительно-восстановительные изменения в первичных культурах нейронов, имеющих значение для патологии, что способствует экстраполяции данных на модели in vivo.
- Механистическое снижение рисков: позволяет дифференцировать специфические редокс-эффекты от артефактов pH с помощью ртиометрических измерений, что повышает уверенность в выбранной мишени.
- Доклиническое соответствие: поддерживает оценку ведущих соединений-кандидатов для защиты митохондрий в моделях глутаматной эксайтотоксичности.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум поиска лекарственных средств — от валидации мишени до оптимизации соединений-лидеров, предоставляя данные об окислительно-восстановительном состоянии, которые позволяют принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки в программах нейропротекции.
- Биология открытий: Поддерживает проверку гипотезы о роли митохондриального глутатиона в нейрональном окислительном стрессе и эксайтотоксичности.
- Скрининг: Обеспечивает количественные соотношения флуоресценции, готовые для анализа, что позволяет надежно сравнивать исследуемые соединения с окислением, индуцированным NMDA.
- Аналитика: Создает ратиометрические показатели (405/488 nm), которые нормализуют уровень экспрессии и артефакты, облегчая сравнение различных условий.
- Трансляционные исследования: Связывает острые редокс-ответы с долгосрочным состоянием митохондрий, что актуально для моделей хронической нейродегенерации.
- Повторное корпоративное использование: Создает повторно используемую платформу визуализации для многопараметрического профилирования митохондрий в рамках нескольких проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в антиоксидантных путях митохондрий за счет прямого измерения окислительно-восстановительного потенциала в режиме реального времени.
- Практическая ценность: Обеспечивает стандартизацию посредством последовального сканирования и рациометрической калибровки, что повышает воспроизводимость результатов между различными лабораториями.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать ранние решения о продолжении или прекращении разработки («go/no-go»), связывая эффекты соединений со стабилизацией редокс-состояния митохондрий, что снижает риск неудач на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию нейропротекторных кандидатов с учетом рисков на основе степени взаимодействия с мишенями в системе редокс-гомеостаза.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с конфокальной микроскопией и прижизненной визуализацией первичных нейронов.
- Метод зависит от наличия лазерного сканирующего конфокального микроскопа с возможностью возбуждения на 405 nm и 488 nm.
- Необходима стандартизация буфера для визуализации, способов доставки препаратов и протоколов калибровки для всех пользователей.
- Адаптация метода для других подтипов нейронов может потребовать оптимизации митохондриального таргетинга и уровней экспрессии.
- Для поддержания жизнеспособности нейронов при тайм-лапс съемке необходимо контролировать фототоксичность и время лазерного облучения.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:55
Optimization of Scanning Confocal Microscope Settings
1:58
Live Imaging of the Mitochondrial Redox Response to N-methyl-D-aspartate (NMDA) Treatment
3:08
Data Analysis
5:40
Results: Effects of N-methyl-D-aspartate (NMDA) on Neuronal Mitochondria Oxidation
7:04
Conclusion
