Caenorhabditis elegans как модельная система для обнаружения биологически активных соединений против полиглутамино-опосредованной нейротоксичности
21 сентября 2021 г.
Здесь мы представляем протокол для оценки нейропротекторной активности тестовых соединений в Caenorhabditis elegans, включая агрегацию полиглутамина, гибель нейронов и поведение химиообнаружения, а также образцовую интеграцию нескольких фенотипов.
В качестве мощной животной модели в нейродегенеративных и поведенческих исследованиях, C.elegans может быть использован для эффективного скрининга и оценки токсичных соединений против нейротоксичности полиглутамина с использованием моделей, подобных болезни Гентингтона. Основным преимуществом данной методики является профилирование и интеграция нескольких фенотипов в разные модели C.elegans. Также на самом деле, как и C.elegans, в этом методе используются модели.
Он обеспечивает размер скрининга и исследования терапевтических кандидатов для других нейродегенеративных задержек и других задержек. Пожалуйста, обратите внимание на температуры, используемые при росте C.elegans, и выполните тест на правильных стадиях разработки. Демонстрировать процедуру будут Цзян Ии, Сиоа Юэ и Ван Цянцян, три аспиранта.
Начните с переноса от 300 до 500 синхронизированных личинок L1 нематод AM141 в каждую лунку 48-луночной пластины с 500 микролитрами среды S, содержащей штамм OP50 E.coli и пять миллиграммов на миллилитр астрагалана. Запечатайте пластину парапленкой и инкубируйте при 20 градусах Цельсия и 120 оборотах в минуту в течение желаемых временных интервалов. Переложите нематод в стерильную 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку и трижды промыть буфером M9 центрифугированием для удаления оставшихся клеток OP50.
Затем повторно суспендируйте нематод AM141 в буфере M9. Теперь перенесите от 10 до 15 нематод в каждую скважину в 384 луночной пластине, установив 10 реплицированных лунок для каждой обработки и добавьте 10 микролитров 200 миллимолярного азида натрия в каждую скважину, чтобы парализовать нематод, позволив им осесть на дно. Поместите пластину в систему визуализации с высоким содержанием для получения флуоресцентных изображений.
Откройте программное обеспечение для получения изображений и настройте параметры, указанные в текстовой рукописи. Проанализируйте данные изображения, открыв окно данных обзорной пластины и выбрав тестовую пластину для анализа изображения. Дважды щелкните по пробной скважине, чтобы отобразить ее изображение.
Затем выберите число ядер в качестве метода анализа и нажмите на кнопку настройки параметров. Определите исходное изображение из канала FITC и выберите стандартный алгоритм. Задайте параметры анализа изображений, как описано в тексте рукописи, и протестируйте их для оптимизации метода анализа.
Сохраните настройки и запустите анализ на всех скважинах. Экспортируйте общее количество ядер как общее количество агрегатов Q40:YFP в каждой скважине. Подсчитайте количество нематод в каждой скважине и рассчитайте среднее количество агрегатов Q40:YFP на нематоду в каждой группе.
Затем рассчитайте индекс торможения. Для подготовки нематод к анализу нейротоксичности polyQ переносят от 300 до 500 синхронизированных личинок L1 нематод HA759 в каждую лунку 48-луночной пластины с 500 микролитрами среды S, содержащей штамм OP50 E.coli и пять миллиграммов на миллилитр астрагалана. После запечатывания пластин инкубируйте, собирайте и повторно суспендируйте нематод в буфере M9, как было продемонстрировано ранее.
Теперь приготовьте в агарозной прокладке, добавив два грамма агарозы к 100 миллилитрам буфера M9 и нагрейте раствор в микроволновой печи почти до кипения. Нанесите 0,5 миллилитра расплавленной агарозы на центр микроскопического стеклянного слайда толщиной в один миллиметр, помещенного между двумя кусками стеклянных пластин толщиной в два миллиметра, покрывая еще одним слайдом вертикально. Аккуратно снимите верхнюю горку, как только агароза остынет и затвердеет.
Начните анализ выживания нейронов ASH, добавив каплю 20 миллимолярного азида натрия на подушечку агроса, а затем переместив от 15 до 20 нематод HA759 в каплю, чтобы обездвижить их. Аккуратно положите крышку поверх нематод. Теперь держите затвор под флуоресцентным микроскопом, оснащенным цифровой камерой.
Выберите объектив 40x и фильтр FITC для обнаружения GFP-положительных нейронов ASH в области головы нематод. Выберите более 50 нематод в каждой группе случайным образом, чтобы подсчитать количество нематод с GFP-мечеными двусторонними нейронами ASH в области головы, а затем рассчитать выживаемость нейронов ASH. Для анализа осмотического избегания разделите пластину NGM без пищи на нормальные и ловушковые зоны, создав восьмимолярную глицериновую линию посередине.
Затем распределите 200-миллимолярную линию азида натрия на расстоянии около одного сантиметра от линии глицерина, чтобы парализовать нематод, пересекающих глицериновый барьер в зону ловушки. Перенесите около 200 нематод каждая в нормальную зону трех реплицированных пластин для каждой группы. Затем добавьте каплю 1% бутандиона в зону ловушки, чтобы привлечь нематод.
Сразу же накройте крышку чашки Петри и высиживайте при 23 градусах Цельсия в течение 90 минут. Оцените количество нематод в обеих зонах под микроскопом и рассчитайте индекс избегания. Трансгенный штамм polyQ AM141 сильно экспрессирует белки слияния Q40: YFP в мышечных клетках стенки тела, идентифицированных этим автоматизированным протоколом визуализации и анализа, увеличение количества которых было ингибировано лечением астрагаланом, демонстрирующим его защитный потенциал.
Потеря флуоресценции GFP и двусторонних нейронов ASH в областях головы нематод указывает на гибель нейронов ASH. Этот анализ выживания нейронов ASH может быть использован для визуальной оценки нейропротекторного эффекта тестовых соединений на нейроны элегантности Caenorhabditis. Хемосенсорный анализ избегания использовался для изучения эффективных тестовых образцов на функциональную потерю нейронов ASH, опосредованную агрегацией polyQ.
Индекс избегания нематод HA759, получавших астрагалан при 15 градусах Цельсия в течение трех дней, увеличился до более чем 0,6, демонстрируя нейропротекторное действие полисахарида против поведенческих нарушений. Для оценки общей нейропротекторной способности исследуемых соединений данные отдельных анализов были интегрированы и представлены в виде радиолокационной диаграммы, показывающей площадь треугольника в группе лечения астрагаланом, большую, чем у контрольной группы, что указывает на антиполиQ эффекты полисахарида. Пожалуйста, имейте в виду, что пища, температура и влажность могут повлиять на их поведение C.elegans.
Обзор
В данном исследовании представлен протокол с использованием Caenorhabditis elegans для оценки нейропротекторной активности соединений в отношении агрегации полиглутамина и гибели нейронов. Благодаря интеграции нескольких фенотипов в исследовании количественно оценивается нейропротекторное действие тестируемых соединений на поведение и целостность нейронов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Нейродегенеративные заболевания
- Поведенческий анализ
Теоретические сведения
- Caenorhabditis elegans служит эффективной моделью для изучения нейродегенеративных заболеваний.
- Данная модель позволяет оценивать воздействие токсических соединений, которые способствуют полиглутаминовой нейротоксичности, что имеет значение для изучения болезни Гентингтона.
- Анализ множества фенотипов позволяет получить представление о потенциальных нейропротективных стратегиях.
- Факторы окружающей среды, такие как температура, имеют критическое значение для роста и функционирования C. elegans.
Цель исследования
- Для оценки нейропротекторного действия соединений на жизнеспособность нейронов.
- Для количественного определения выживаемости нейронов и поведенческих реакций в контексте полиглутаминовой токсичности.
- Для демонстрации интеграции различных методов анализа для проведения комплексного исследования.
Используемые методы
- В качестве основной модельной системы для исследования нейропротекции использовались C. elegans.
- Анализы включали оценку выживаемости нейронов и тесты на хемосенсорное избегание.
- Различные стадии развития нематоды имеют критическое значение для эффективного скрининга.
- Методы включали перенос нематод в многолуночные планшеты для обработки и последующего анализа с помощью систем флуоресцентной визуализации.
- Количественное определение полиглутаминовых агрегатов и выживаемости нейронов проводилось путем анализа изображений и расчета показателей выживаемости.
Основные результаты
- Обработка астрагаланом привела к значительному сокращению агрегатов Q40:YFP, что указывает на защитный эффект против полиглутаминовой токсичности.
- Количественно оценивали выживаемость нейронов ASH, что выявило изменения, связанные с нейропротекторным лечением.
- Поведенческие тесты показали улучшение индексов избегания, что коррелирует с усилением защиты нейронов.
- Интеграция данных анализов позволила провести комплексную оценку защитных эффектов, представленную на радарных диаграммах.
Выводы
- Данное исследование подтверждает нейропротекторный потенциал соединений с использованием надежной модели C. elegans.
- Интегрированный подход позволяет детально изучить механизмы, лежащие в основе нейропротекции.
- Полученные данные могут быть использованы для разработки будущих терапевтических стратегий лечения нейродегенеративных заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный протокол позволяет проводить валидацию мишеней на ранних стадиях и механистическое снижение рисков при изучении полиглутамин-опосредованной нейродегенерации путем интеграции фенотипических показателей клеточной агрегации, выживаемости нейронов и поведенческих функций на масштабируемой модели беспозвоночных. Этот подход повышает прогностическую достоверность идентификации ведущих соединений за счет корреляции молекулярного ингибирования с функциональным восстановлением, что помогает в приоритизации портфеля программ по исследованию нейродегенеративных заболеваний. Интеграция многопараметрических данных в виде лепестковых диаграмм облегчает кросс-функциональное сравнение эффективности соединений, ускоряя принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) в рабочих процессах поиска новых лекарственных средств.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: Проверка терапевтических гипотез путем количественного определения ингибирования агрегации полиглутамина в мышечной ткани в качестве прямого показателя взаимодействия с мишенью.
- Научная ценность: Подтверждение функциональной значимости мишени путем оценки выживаемости ASH-нейронов, что позволяет связать молекулярные эффекты с нейропротекцией.
- Практическая ценность: Обеспечение возможности проведения анализа агрегации на основе высококонтентного имиджинга в 384-луночном формате, что способствует стандартизации и воспроизводимости анализа.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает количественное измерение зависимых переменных (общее количество на одну нематоду, уровень выживаемости нейронов, индекс избегания), что позволяет проводить профилирование зависимости «доза-эффект» и валидацию хитов.
- Практическая ценность: использование синхронизированных личинок L1 и определенных условий культивирования (среда S, OP50, астрагалан) обеспечивает воспроизводимость анализа в повторных лунках и экспериментальных группах.
- Практическая ценность: применение паралича с помощью азида натрия и стандартизированных параметров визуализации позволяет минимизировать поведенческую вариабельность и максимально увеличить пропускную способность при сборе данных флуоресцентного анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Демонстрирует трансляционную преемственность, связывая снижение агрегации polyQ::YFP с сохранением структуры нейронов и улучшением хемосенсорного поведения, что обосновывает снижение рисков на основе механизма действия.
- Научная ценность: Обосновывает готовность к фенотипическому скринингу путем профилирования нескольких релевантных заболеванию фенотипов в рамках одного рабочего процесса, что повышает прогностическую ценность для сложных нейродегенеративных показаний.
- Практическая ценность: Облегчает межкомандное взаимодействие за счет стандартизированной интеграции данных в лепестковые диаграммы, обеспечивая единую интерпретацию нейропротекторного потенциала в отделах биологии, скрининга и аналитики.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод позволяет интегрировать оценку соединений в общий процесс поиска лекарственных средств — от валидации мишени до идентификации лида, при этом мультифенотипическое профилирование обеспечивает как подтверждение значимости мишени, так и прогностическую ценность данных перед началом доклинических исследований.
- Поисковая биология: Поддерживает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей путем измерения ингибирования агрегации полиглутамина в качестве проксимального биомаркера модуляции мишени в системе, релевантной заболеванию.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа за счет количественных показателей (Q40: количество агрегатов YFP на одну нематоду, выживаемость ASH-нейронов, индекс избегания), которые позволяют проводить надежную оценку соединений и устанавливать зависимость «структура — активность».
- Аналитика: Генерирует нормализованные, сопоставимые результаты анализов, которые служат основой для статистического анализа и отбора хитов на базе интегрированных нейропротекторных профилей.
- Трансляционные исследования: Связывает молекулярные, клеточные и поведенческие конечные точки для моделирования потенциала модификации заболевания, что соответствует требованиям преклинической преемственности для нейродегенеративных мишеней.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократную платформу скрининга полиглутаминовых расстройств, помимо болезни Гентингтона, включая спиноцеребеллярные атаксии, с использованием консервативных моделей заболеваний на C. elegans.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности за счет корреляции антиагрегационной активности с выживаемостью нейронов и функциональным восстановлением, что снижает механистическую неопределенность при валидации мишени.
- Операционная ценность: Стандартизация и воспроизводимость благодаря определенному стадированию личинок, контролю температуры (20°C для агрегации, 23°C для избегания) и рабочим процессам слепого анализа изображений.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о целесообразности дальнейшего развития (go/no-go) за счет требования соответствия различных ортогональных фенотипов, что снижает количество ложноположительных результатов при скрининге с использованием одного анализа.
- Влияние на портфель: Приоритизация с поправкой на риск на основе профилей эффективности, полученных с помощью лепестковых диаграмм, что обеспечивает экономически эффективное продвижение соединений с мультимодальной нейропротекторной активностью.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с C. elegans, поддержания трансгенных линий и использования флуоресцентной микроскопии для детектирования сигналов FITC/YFP.
- Метод зависит от доступа к системам высокопроизводительного имиджинга с возможностью автоматизации работы с 384-луночными планшетами и стандартизированным алгоритмическим подсчетом ядер и агрегатов.
- Необходимо согласование параметров анализа изображений между исследовательскими группами (исходный канал, настройки порога, область интереса) для обеспечения согласованности данных между различными центрами.
- При распространении метода на другие модели polyQ (например, экспрессия в нейронах в отличие от мышц) или альтернативные показатели (например, подвижность, продолжительность жизни) требуются соответствующие корректировки.
- Практические ограничения включают чувствительность к температуре, влияющую на пенетрантность фенотипа, и необходимость синхронизации популяций личинок для минимизации вариабельности развития.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:12
PolyQ Aggregation Assay
3:29
PolyQ-Mediated Neurotoxicity Assays
6:18
Results: Analysis of the Overall Neuroprotective Capacity of Astragalan and its Effect on PolyQ40 Aggregation, Neuronal Death, and Behavioral Dysfunction
7:51
Conclusion
