Межфазная флуоресценция in situ Гибридизация мазков костного мозга множественной миеломы
15 апреля 2022 г.
Здесь мы представляем протокол для улучшения успеха обнаружения интерфазной флуоресцентной гибридизации in situ на мазках костного мозга у пациентов с множественной миеломой.
Применение флуоресцентной гибридизации in situ, называемой FISH, к стратификации генетического риска при множественной миеломе имеет важное значение. Критической частью отчетов FISH являются не все ядерные клетки, а клональные плазматические клетки, специально очищенные или идентифицированные путем сортировки с помощью магнитных шариков против CD138 или маркировки цитоплазматической каппой или лямбда-иммуноглобулином с легкой цепью с помощью тестирования FISH, называемого cIg FISH. Межфазный FISH после сортировки плазматических клеток или cIg FISH оказывается значимым в диагностике множественной миеломы, из-за относительно меньшей доли плазматических клеток в костном мозге.
Однако эти методы имеют некоторые недостатки, включая сложные процессы, высокие требования к образцам и высокие экспериментальные затраты. Плазматические клетки могут быстро располагаться в мазке костного мозга. Исходя из этого, мы используем мазок костного мозга FISH для обнаружения множественных клеток миеломы.
Это исследование было проведено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и одобрено Комитетом по этике больницы Чжуннань Уханьского университета. Образцы были собраны у пациента с множественной миеломой в отделении гематологии больницы Чжуннань Уханьского университета Китая. Поместите первые 0,2 миллилитра раствора костного мозга на чистую одноразовую стеклянную горку, распределите мазки костного мозга до равномерной толщины и острых хвостов, быстро удалив костный мозг, а затем высушите его естественным путем.
Накройте пленки костного мозга одним миллилитром раствора Райта-Гимса в течение примерно 10 секунд при комнатной температуре. Добавьте один миллилитр фосфатного буфера к слайдам, чтобы предотвратить высыхание или стекание раствора красителя с горок. Аккуратно перемешайте раствор красителя и выдерживайте его в течение 15 минут при комнатной температуре.
Промойте горки чистой водой и высушите ее на воздухе при комнатной температуре. Используйте прямую световую микроскопию для выявления злокачественных плазматических клеток, плазматические клетки должны быть хорошо диспергированы. Теперь то, что мы видим в поле, - это плазматические клетки, которые довольно рассеяны.
Это типичная бинуклеарная ядерная плазматическая клетка. Накройте гибридизированную область фиксирующим раствором на 10 минут, чтобы обесцвечить и зафиксировать плазматические клетки. Промойте горку деионизированной водой и высушите ее на воздухе при комнатной температуре.
Разогрейте банку, содержащую два раза буфер SSC, до 56 градусов Цельсия на водяной бане. Вымойте подготовленный мазок костного мозга в предварительно разогретом два раза буфере SSC в течение 10 минут с последующим погружением в деионизированную воду комнатной температуры. Обезвоживать мазок в градиенте этанола 70%85% и 100% этаноле каждый в течение одной минуты.
Высушите мазок на воздухе в течение 10 минут. Сначала добавьте TP53 на центромеру смеси зонда хромосомы 17 в область гибридизации и накройте ее покровным скользящим прессом осторожно мелкоконечным пинцетом, чтобы удалить пузырьки воздуха снизу. Запечатайте все стороны крышки резиновым цементом, чтобы обеспечить хорошую герметичность.
После затвердевания резинового цемента затвор помещали на автоматическую машину FISH, денатурацию выполняли при 78 градусах Цельсия в течение пяти минут с последующей гибридизацией при 37 градусах Цельсия в течение ночи. Поднимите слайд с машины FISH. Используйте тонкий заостренный пинцет, чтобы аккуратно удалить резиновый цемент.
Погрузите слайд в два раза SSC при комнатной температуре примерно на одну или две минуты, чтобы смыть крышку. Мойте горку в буфере предварительного нагрева при температуре 68 градусов Цельсия на водяной бане в течение двух минут. Мойте горки два раза SSC на водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия в течение одной минуты.
Установите прямо в темноте, чтобы тщательно высохнуть в течение 10 минут на 10 микролитров DAPI в гибридизированную область, накройте крышкой. Просмотрите гибридизированный слайд с помощью подходящего фильтра, установленного на флуоресцентном микроскопе, используйте монохроматический синий флуорофорный оптический фильтр для наблюдения за интенсивностью флуоресценции ядра клетки. Делайте снимки клеточного ядра под набором фильтров DAPI.
CEP17 был помечен зеленой флуоресценцией. Используйте спектр зеленого флуорофорного оптического фильтра для наблюдения за местоположением CEP17. Возьмите изображение сигналов CEP17 под зеленым фильтром.
Ген TP53 был помечен оранжевой флуоресценцией. Используйте спектр оранжевого флуорофорного оптического фильтра для наблюдения TP53, возьмите изображение сигналов TP53 под набор, объедините эти три изображения в целое и изучите на наличие числовых аномалий. В нормальной межфазной клетке внутри ядра наблюдаются два оранжевых и два зеленых сигнала с синей флуоресценцией, указывающей на одну пару нормальных хромосом 17.
Результаты показали морфологию и генетику костного мозга у пациента с множественной миеломой. Рисунок А показал, что 15% плазматических клеток в мазке костного мозга были обнаружены более крупными и темными и ядерными наряду с большим количеством цитоплазмы, чем обычно. На рисунке B показано изображение серой шкалы представителя ядерной плазматической клетки в мазке костного мозга.
На рисунке C показаны четыре оранжевых и четыре зеленых сигнала в одном межфазном ядре плазматической клетки, предполагающие, что четыре копии хромосомы 17 были локализованы в ядре. Рисунок D показал, что аномальная хромосомная кариограмма этого пациента подтвердила две пары хромосом 17 в одном ядре. Мазки костного мозга получить гораздо легче, чем антикоагулянтные образцы костного мозга, потому что получение антикоагулянтного костного мозга требует сложных процедур для получения ядра.
Соответственно, мы установили убедительный метод мазка костного мозга FISH для выявления множественных клеток миеломы.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол повышения эффективности метода флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) на интерфазных ядрах в мазках костного мозга пациентов с множественной миеломой. В исследовании подчеркивается важность точной идентификации клональных плазматических клеток для постановки эффективного диагноза.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Онкология
- Генетика
Теоретическое обоснование
- Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) имеет решающее значение для стратификации генетического риска при множественной миеломе.
- Для точного составления отчета FISH необходимо специфически идентифицировать клональные плазматические клетки.
- Современные методы имеют ряд ограничений, включая сложность и высокую стоимость.
- Мазки костного мозга могут способствовать более быстрой идентификации плазматических клеток.
Цель исследования
- Улучшить выявление клеток множественной миеломы с помощью FISH-анализа мазков костного мозга.
- Устранить недостатки существующих методов FISH.
- Оптимизировать процесс идентификации клональных плазматических клеток.
Используемые методы
- Использование магнитных бусин с анти-CD138 для сортинга плазматических клеток.
- Применение маркировки цитоплазматическими каппа- или лямбда-легкими цепями иммуноглобулинов.
- Проведение FISH-анализа интерфазных ядер после сортинга плазматических клеток.
- Использование FISH-анализа мазков костного мозга для эффективного обнаружения.
Основные результаты
- FISH-анализ мазков костного мозга эффективно выявляет клетки множественной миеломы.
- Повышение точности диагностики множественной миеломы за счет направленного обнаружения плазматических клеток.
- Снижение требований к объему биоматериала и затрат на эксперимент по сравнению с традиционными методами.
- Усовершенствованный протокол способствует более быстрой постановке диагноза и планированию лечения.
Выводы
- В исследовании представлен жизнеспособный альтернативный метод обнаружения клеток множественной миеломы.
- FISH-анализ мазков костного мозга позволяет преодолеть ограничения существующих методов FISH.
- Будущие исследования могут быть сосредоточены на дальнейшей оптимизации данного метода для клинического применения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод устраняет основное препятствие в диагностике множественной миеломы, позволяя проводить анализ FISH на общедоступных мазках костного мозга, что снижает зависимость от свежих гепаринизированных аспиратов. Это способствует более быстрому и доступному генетическому расслоению по группам риска в процессах гематологической онкологии, особенно в случаях, когда забор образцов затруднен. Данный подход улучшает трансляционную непрерывность за счет повышения доступности биоматериала без потери специфичности в отношении клональных плазматических клеток.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать хромосомные аномалии в клональных плазматических клетках непосредственно по мазкам, что способствует механистическому снижению рисков при определении геномных мишеней.
- Практическая ценность: снижает сложность подготовки образцов за счет исключения необходимости сортировки или обогащения клеток перед проведением FISH.
Скрининг и разработка метода анализа
- Научная ценность: Предоставляет стандартизированную платформу на основе мазков для интерфазного FISH-анализа, что повышает готовность анализа при работе с образцами с низким выходом или образцами, которые трудно получить.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость за счет минимизации преаналитических переменных, связанных с обращением и обработкой свежего аспирата.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает поддержку исследований с использованием биомаркеров за счет сохранения пространственного контекста плазматических клеток в мазках, что позволяет сопоставить морфологию с генетическими аберрациями.
- Практическая ценность: Облегчает лонгитюдный мониторинг в доклинических моделях, в которых повторная аспирация костного мозга нецелесообразна.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум от открытия до трансляции, обеспечивая осуществимый рабочий процесс FISH при ограниченном количестве первичных образцов, что позволяет проводить последующий генетический анализ без задержки процесса идентификации перспективных соединений или доклинической валидации.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез о клональных геномных изменениях, позволяя проводить FISH на архивных мазках костного мозга или мазках, трудноподдающихся обработке.
- Скрининг: повышает стандартизацию анализа за счет использования мазков в качестве однородного субстрата для гибридизации и детекции сигнала.
- Аналитика: позволяет проводить количественную оценку изменений числа копий хромосом (например, TP53, CEP17) в интерфазных ядрах, что необходимо для стратификации рисков.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации, позволяя проводить повторный забор проб с помощью мазков в лонгитюдных исследованиях.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает воспроизводимый протокол подготовки мазков для FISH, применимый к различным моделям множественной миеломы и типам образцов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозирования при оценке геномного риска, обеспечивая возможность проведения FISH на образцах, которые в противном случае были бы непригодны для анализа.
- Операционная ценность: Увеличивает пропускную способность лаборатории и сокращает время выполнения анализов за счет упрощения подготовки образцов.
- Стратегическая ценность: Снижает биологические и технические риски при принятии ранних решений за счет расширения доступа к критически важным цитогенетическим данным.
- Влияние на портфель: Поддерживает продвижение проектов с поправкой на риск, делая возможной стратификацию на основе FISH в условиях ограниченных ресурсов или в клинических условиях.
Особенности реализации
- Требуется опыт в разработке FISH-зондов, проведении гибридизации и флуоресцентной микроскопии для точной интерпретации сигнала.
- Зависит от наличия стандартного оборудования для FISH, включая камеры гибридизации, промывочные буферы и наборы фильтров для DAPI, spectrum green и spectrum orange.
- Необходимо стандартизировать протоколы приготовления мазков и окрашивания для обеспечения однородной морфологии и сохранности плазматических клеток.
- При определении глубины выборки и порогов количественной оценки сигнала необходимо учитывать вариабельность плотности плазматических клеток в различных мазках.
- Метод ограничен анализом интерфазы; не позволяет проводить метафазное кариотипирование или выявлять структурные перестройки без применения дополнительных методов.
