Ручное построение тканевого микрочипа с использованием ленточного метода и портативного микрочипа

Тканевый микрочип, или ТМА, является важным исследовательским инструментом, который собирает небольшие примерные кусочки ткани, известные как тканевые ядра из закрепленных формалином парафиновых встроенных тканевых блоков, называемых донорскими блоками, в один блок парафина. Ленточный метод представляет собой полностью ручной метод строительства, который инвертирует процесс строительства путем литья блока вокруг вертикальных сердечников и, таким образом, совместим с неидеальными донорскими блоками и использует недорогие, широко доступные одноразовые тканевые микрочипы. Многоступенчатый рабочий процесс этого процесса продемонстрируют г-н Ли Виснер и д-р Брэндон Ларсен.

Одной из наиболее важных концепций, которые следует помнить при построении блоков ТМА, является тот факт, что ткани в формалин-фиксированных парафиновых встроенных тканевых блоках на самом деле являются трехмерными структурами. Мы разработали анимацию здесь, чтобы помочь объяснить эту концепцию. То, что вы видите здесь, - это анимация, изображающая закрепленный формалином блок ткани, встроенный в парафин, показывающий трехмерную природу этой ткани внутри блока.

Вы можете видеть, что ткань видна в верхней части блока, и эта область довольно большая. Если бы мы могли иметь рентгеновское зрение, так сказать, и видеть сквозь блок, мы могли бы увидеть, что ткань на самом деле не имеет равномерной формы глубже в этом блоке, почти как айсберг в океане, где то, что вы видите на поверхности, может на самом деле не представлять то, что внизу. Внутри этого тканевого блока могут быть дополнительные кусочки ткани, которые не видны на поверхности.

Могут быть области некроза или гибели тканей в центре этой ткани глубже. Патологоанатом должен фактически просмотреть этот двумерный участок в верхней части этого тканевого блока, а затем аннотировать этот слайд, чтобы показать области, которые содержат интересующую ткань и исключают некроз или другие типы тканей, которые на самом деле не представляют интереса. Чтобы облегчить правильный забор керна ткани, патологоанатом должен сделать три вещи.

Во-первых, используя ручку для маркировки слайдов, патологоанатом отметит интересующую ткань на слайде, чтобы можно было избежать других тканей. Во-вторых, если в этой области интересов есть области, которых следует избегать, патологоанатом может использовать ту же маркировочную ручку, чтобы стереть те области, которые не должны быть отобраны. И, наконец, предпочтительно используя другой цвет ручки, патологоанатом должен отметить те области, которые идеально подходят в пределах области, представляющей интерес для отбора проб керна и построения TMA.

Важно иметь в виду, что когда этот процесс завершен, состав ткани может измениться глубже внутри того места, где получен образец ядра, и мы покажем это здесь, в анимации, что местоположение ядра будет определять состав этого ядра, который будет варьироваться в зависимости от глубины ткани и того, что присутствует в этом блоке. Например, здесь первое ядро, которое мы иллюстрируем, захватывает часть ткани в ее верхней половине, но глубже внутри блока больше нет ткани, из которой это ядро получено, поэтому был взят образец только парафинового воска. Второе ядро, которое мы проиллюстрировали здесь, захватило ткань по всей ее длине, потому что ткань присутствует по всей глубине этого блока в этом месте.

Третье ядро захватило часть ткани, а затем захватило часть парафинового воска в центре, где не было ткани, а затем захватило немного больше ткани на нижнем конце, где была ткань в нижней части этого блока. Как только обзор патологии будет завершен, составьте окончательный список донорских блоков для использования в конструкции TMA, а затем создайте карту TMA. Карта TMA представляет собой схему, описывающую, где ядра будут расположены в завершенном TMA и слайдовых участках ткани, вырезанных из полученного TMA.

Для целей ориентации убедитесь, что карта TMA позволяет избежать размещения ядер в четной матрице, такой как матрица «три на три» или «четыре на четыре», и включает по меньшей мере один маркер ориентации. Поскольку ленточный метод инвертирует процесс строительства путем заливки расплавленного воска вокруг перевернутых ядер, это требует создания второй карты, известной как строительная карта, которая является зеркальным отражением карты TMA. Строительная карта показывает, где каждый керн должен быть размещен во время строительства, чтобы появиться в правильном месте в завершенном TMA.

После того, как карты будут созданы, подготовьте металлическую базовую форму TMA. Для руководства размещением сердечника используйте одноразовую бумажную клетчатую сетку. Разрежьте бумажную клетчатую сетку по размеру и прикрепите кусок двойной клейкой ленты к задней части сетки.

Поместите сетку и ленту в металлический лоток и добавьте второй кусок двойной ленты поверх сетки. Наложите рассмотренный патологией слайд H & E на тканевый блок FFPE, который должен быть пробит, и используйте маркировку патологоанатома, чтобы определить, где блок ткани должен быть пробит. Используя ручной перфоратор сердечника, одноразовый или многоразовый, пробивайте донорский блок FFPE в соответствующей области.

При использовании многоразового сердечника убедитесь, что он очищен до и после каждого удара ткани. Извлеките сердечник из сердечника. Используйте игольчатый отмычку, чтобы поместить выброшенное ядро на перекрестие сетки, покрытой двойной лентой.

Убедитесь, что ядро размещено в перевернутом, вертикальном режиме таким образом, чтобы тканевый конец сердечника контактировал с лентой и находился в правильном месте, как указано на карте конструкции. Повторяйте до тех пор, пока все донорские блоки не будут очищены и ядра не будут размещены в соответствующих положениях. Как только все сердечники будут на месте, наклейте этикетку на пластиковую кассету и поместите ее поверх металлической основы, содержащей сердечники.

Высота сердечников не должна превышать глубину металлического лотка, так как высокие сердечники будут наклоняться или опрокидываться при установке кассеты на место. Аккуратно вылить расплавленный парафин через кассету в лоток с сердечниками. Позвольте расплавленному парафину переполниться, чтобы убедиться, что в теле ТМА нет пузырьков воздуха.

Убедитесь, что парафин заполняется до верхней части кассеты таким образом, что кассета встроена и прочно привязана к парафиновому блоку после его затвердевания. Дайте блоку остыть при комнатной температуре в течение 30 минут и не перемещайте блок в течение этого времени. Охладите блок при четырех градусах Цельсия в течение дополнительных 30 минут, чтобы полностью затвердеть.

После полной установки аккуратно отделите металлическую базовую форму и снимите двойную ленту с парафинового блока. После того, как TMA будет построен, используйте микротом для секционирования нового TMA. После того, как блок был соответствующим образом облицован, соберите полные участки тканей лица.

Переложите секции на предварительно подогреваемую водяную баню и смонтируйте тканевые срезы. После высыхания представьте репрезентативные секции для окрашивания H & E и любые дополнительные иммуногистохимические пятна, которые могут потребоваться. Отправьте окрашенные участки ТМА на патологическое рассмотрение.

Для проверки TMA патологоанатом должен просмотреть слайд H & E из блока TMA и просмотреть каждое круглое пятно под микроскопом, чтобы увидеть, присутствует ли интересующая ткань. Критическим компонентом процесса строительства является идентификация тканей, представляющих интерес в данном донорском блоке, из которого должно быть получено ядро TMA. В первой колонке этого рисунка показан примерный донор H&Es с отметками патологоанатома.

Во втором столбце показана перфорированная область окрашенных H&E тканей. В третьем столбце показана окрашенная H&E ткань ядер TMA, которые были собраны из донорских блоков в областях, показанных в столбцах один и два. Патологоанатом может просматривать соответствующий донорский блок и ядро TMA H&Es вместе, чтобы подтвердить, что интересующая область была собрана и что состав ткани одинаков.

Существует два основных показателя успешного завершения TMA ленточным методом. Во-первых, это наличие тканевых стержневых точек в ожидаемых положениях и на расстоянии друг от друга, что оценивается путем визуального осмотра. На изображениях, показанных в форматах A и B, изображены два успешно завершенных TMA ленточного метода и соответствующие слайды H&E.

Визуальные осмотры этих блоков TMA показывают, что ядра присутствуют и регулярно размещаются в каждом TMA и соответствующих им секциях. Некоторые из основных конструктивных проблем, которые могут возникнуть в процессе строительства ленточным методом, включают разделение блока и кассеты из-за преждевременного удаления металлического основания перед затвердеванием, как показано на рисунке C.Опрокидывание и/или дрейф размещения встроенных сердечников, как показано на рисунке D, может произойти при чрезмерно турбулентном заливке расплавленного парафина, которая может ухудшиться из-за плохо клейкой двусторонней палочной ленты. На этом рисунке показано, что пятно H&E для каждого из сердечников является образцовым TMA.

Все, кроме одного из основных пятен, присутствуют в H&E. Рисунок также показывает, что некоторые из ядер присутствуют в виде полных круговых тканевых точек, в то время как другие не полностью присутствуют. Такая потеря тканей не является редкостью и может быть связана с недостаточной облицовкой блока, чтобы выявить все ядра в полном объеме.

Альтернативно, наличие неполной или полного отсутствия ткани может быть связано с плохим качеством тканей этого ядра, что может привести к потере ткани во время процесса окрашивания. На этом следующем рисунке иммуногистохимия и окрашивание РНК ISH были выполнены на участках TMA для дальнейшей проверки TMA. Как показано здесь, различные пятна могут быть использованы в зависимости от ткани, используемой для построения TMA.

Виментин используется в качестве средства контроля качества. U6 является показателем качества РНК. EBER используется для определения статуса EBV.

А CD20 является маркером В-клеток, указывающим на наличие В-клеток. Это несколько пятен, которые могут быть использованы для проверки вашего TMA. Посмотрев это видео, вы должны понять, как сделать тканевый микрочип с помощью ленточного метода и почему TMA являются важными инструментами исследования, экономящими время и ресурсы.

Вы также должны понимать, что построение ТМА не является идеальным процессом и что постоянное патологическое руководство и обзор являются критическими компонентами не только в процессе строительства, но и для иммуногистохимических исследований, выполняемых на участках ТМА, чтобы убедиться, что ткань, представляющая интерес, действительно присутствует в разделе ТМА.