Иммуноцитохимический анализ живых 3D-клеток диффузной срединной глиомы у детей

Диффузная срединная глиома является высокоинвазивной опухолью головного мозга. Этот метод помогает в режиме реального времени изучать, как клетки DMG мигрируют и проникают в 3D-контекст с конкретным пониманием потенциальной роли ключевой молекулы адгезии. Используя реагент для мечения и специфическое антитело против CD44, мы можем изучить с помощью визуализации живых клеток экспрессию CD44 на плазматической мембране на клетках DMG, а также при 3D-миграции и инвазии.

Применение этого метода подчеркнуло потенциальную роль CD44 в подвижности этих клеток, предполагая, что он может представлять собой ценную и инвазивную молекулярную мишень. Для начала регидратируйте ALR, добавив 100 микролитров стерильной воды, и перемешайте раствор с помощью пипетирования. Смешайте антитело с ALR в среде TSM в многолуночном планшете с круглым дном или в янтарной пробирке и защитите его от света.

Приготовьте достаточное количество среды для дозирования 25 микролитров на лунку при трехкратной конечной концентрации анализа, а затем инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут. Разбавляют BSR в среде TSM при концентрации 1,5 миллимоляра для получения конечной концентрации 0,5 миллимоляра в конце анализа. Затем аккуратно и медленно удалите 75 микролитров среды из каждой лунки, избегая касания дна лунки, где находится НС и проверяя наличие НС визуально.

Аккуратно добавьте 25 микролитров комплекса антител BSR и ALR в каждую лунку и дайте комплексу антител ALR смешаться со средой в течение двух-трех минут. Используя инвертированный микроскоп, убедитесь, что каждый NS расположен по центру на дне лунки. Избежать образования пузырьков можно, удалив их с помощью иглы.

Поставьте тарелку на лед на пять минут, чтобы дно тарелки остыло. Дозируйте 75 микролитров BMM на лунку, поместив предварительно охлажденный наконечник P200 на внутреннюю стенку скважины, избегая образования пузырьков и касаясь дна лунки. Оставьте тарелку на льду на пять минут, чтобы BMM смешался со средой.

С помощью инвертированного микроскопа проверьте расположение НС. А если он отсутствует в центре, центрифугируйте планшет при температуре четыре градуса Цельсия при 180 градусах G в течение пяти минут. Затем перенесите планшет в прибор для анализа живых клеток, помещенный в инкубатор, установленный при температуре 37 градусов по Цельсию, 5% углекислого газа и 95% влажности. После того, как лунки будут покрыты BMM, обрежьте наконечник P200.

Из каждой выбранной лунки берут по 50 микролитров клеточной среды и НС и переносят в лунку с плоским дном с покрытием. Проверьте наличие и положение НС в каждой скважине визуально. Аккуратно добавьте 50 микролитров разбавленных антител BSR и ALR в каждую лунку, подождите две-три минуты, чтобы реагенты смешались.

А с помощью инвертированного микроскопа убедитесь, что большая часть репликаций NS расположена по центру лунки. Убедившись в отсутствии пузырьков, осторожно перенесите планшет в прибор для анализа живых клеток, как было показано ранее. В программном обеспечении прибора для анализа живых клеток выберите опцию «Расписание» для получения, затем нажмите на вкладку «плюс» и выберите «Сканировать по расписанию», чтобы сканировать планшеты с интервалами, указанными в текстовой рукописи.

В окне программного обеспечения создайте или восстановите судно, а затем нажмите на опцию Создать. Выберите тип сканирования сфероида, фазу плюс светлое поле, зеленые каналы изображения для анализа инвазии и 4-кратный объектив. Выберите сканирование клонирования с разбавлением, объектив типа 4X, а также фазу и зеленый цвет для анализа миграции.

Выберите тип пластины и определите скважины для сканирования, выделив их на карте пластины, а затем настройте частоту сканирования. Нажмите «Добавить в расписание» и запустите сканирование. Перейдите на вкладку Создать новое определение анализа.

Затем на вкладке выберите spheroid invasion или basic analyzer application for invasion и migration соответственно. Выберите каналы, соответствующие вторжению и миграции, в канале образа. Выберите несколько репрезентативных изображений из трех-четырех лунок для предварительного просмотра и уточнения параметров анализа.

Для инвазионного анализа на вкладке определения анализа настройте параметры приложения в светлом и зеленом каналах с настройками, указанными в текстовой рукописи, чтобы создать точную сегментацию между сфероидом и вторгающимися клетками. Для миграционного анализа отрегулируйте параметры приложения, как указано в текстовой рукописи, в фазовом и зеленом каналах, чтобы создать точную сегментацию между слиянием и зелеными клетками. Проверьте правильность настроек анализа для NS, щелкнув случайным образом по нескольким лункам.

Выберите скважины и временные точки для анализа. Сохраните определение анализа и нажмите кнопку Готово. Репрезентативные иммунофлуоресцентные конфокальные изображения экспрессии CD44 в первичных клетках, полученных от пациентов с помощью DMG, продемонстрировали роль CD44 в клеточной миграции и инвазии.

Живая 3D-клеточная иммунохимия позволяет визуализировать экспрессию CD44. Репрезентативные кадры временной задержки как для миграции, так и для инвазии показывают наличие и отсутствие зеленого флуоресцентного сигнала на одной и той же клетке, наблюдаемой с течением времени, что позволяет предположить, что экспрессия CD44 включается и выключается во время миграции и вторжения клеток. Процессы миграции и инвазии наблюдаются в течение 96 часов, показывая клетки QCTB-R059 с высоким уровнем CD44.

Количественную оценку экспрессии CD44 и ее увеличение с течением времени измеряли по общему сигналу зеленой флуоресценции, связанному с ALR как для миграции, так и для инвазии. Когда антитело к CD44 используется на живых клетках, оно влияет на морфологию клеток, индуцируя переход от мезенхимальноподобной инвазии к амебоидной и снижая инвазивную и миграционную способность этих клеток. Наиболее важным этапом метода является смешивание реагента для мечения с антителом, добавление смеси к Matrigel и среде, а также доступ к прибору для визуализации живых клеток.

Этот метод может быть дополнительно реализован путем использования двух или более различных реагентов для мечения и антител для исследования взаимодействия клеток DMG, опосредованного прямыми клетками и контактом. Наш метод предлагает новые инструменты для исследования в 3D клеточных и молекулярных механизмов миграции и инвазии DMG, предоставляя новые направления для ингибирования их инфильтративного фенотипа.