Применение пассивного движения головы для генерации определенных ускорений на головах грызунов
July 21st, 2022
Настоящий протокол описывает специально разработанную систему «пассивного движения головы», которая воспроизводит механические ускорения на головах грызунов, генерируемые во время беговой дорожки с умеренными скоростями. Это позволяет препарировать механические факторы / элементы от благотворного воздействия физических упражнений.
Наш протокол помогает ответить на вопросы о том, как физические упражнения поддерживают гомеостаз организма. Системы позволили нам препарировать прямое механическое воздействие на мозг от сложных последствий физических нагрузок, таких как ходьба и бег трусцой. Для начала закрепите акселерометр поверх головы крысы с помощью хирургической ленты.
После полного восстановления после анестезии поместите крысу в тренажер беговой дорожки. Отрегулируйте беговую дорожку до умеренной скорости в 20 метров в минуту. Используйте прикладное программное обеспечение для измерения величины вертикальных ускорений вдоль осей X, Y и Z, когда крыса работает на беговой дорожке.
Сопоставьте значения, полученные от программного обеспечения, с величиной в частоте вертикального ускорения в системе PHM. Предустановлена амплитуда колебаний платформы и скорость вращения кулачка пропеллера. Затем поместите мышь в положение лежа с головой, расположенной на колеблющейся, а остальной частью тела на статических платформах.
Включите двигатель, чтобы колебать платформу вертикально и применить PHM к мыши. В прозрачном пластиковом корпусе настройте видеокамеру со скоростью кадров 24 FPS для записи всего пространства. Затем внутрибрюшинно вводят мышь пять гидрокситриптофана.
Поместите мышь в прозрачную клетку и начните запись в течение 30 минут. Просмотрите записанное видео на скорости 0,5x и подсчитайте подергивание головы вручную. Извлеките криосекции мозга мыши из слайд-бокса.
Оставьте слайды на чистых салфетках при комнатной температуре до тех пор, пока образцы полностью не обезвоживаются. Используйте ручку блокатора жидкости, чтобы нарисовать круг вокруг криосекционной ткани. Затем добавьте раствор TBS-T.
На дно лотка поместите влажные салфетки, чтобы создать влажную среду для горок. После пермеабляции TBS-T добавляют 4% ослиную сыворотку для блокировки и инкубируют при комнатной температуре в течение одного часа. Промойте слайды один раз, погрузившись в TBS-T на пять минут.
Затем нанесите 100 микролитров соответствующим образом разбавленного первичного антитела и смеси dappy на каждый слайд. Накройте лоток и высиживайте при комнатной температуре на ночь. После инкубации промыть TBS-T трижды в течение пяти минут каждый.
Применяют 100 микролитров соответствующим образом разбавленных видов флуоресцентных вторичных антител и инкубируют при комнатной температуре в течение одного часа. Послеполаскивайте TBS-T трижды в течение пяти минут каждая, монтируйте горки монтажным носителем и накрываете горки крышкой. После монтажа просмотрите образец под флуоресцентным микроскопом.
Система PHM была скорректирована для получения пиков вертикального ускорения примерно в 1,0 раза больше G, что было эквивалентно головам крыс во время бега на беговой дорожке. Применение PHM к мышам значительно ослабило их реакцию на подергивание головы по сравнению с контрольными мышами, представляющими супрессивный эффект PHM на передачу сигналов рецептора 5-HT2A в нейронах префронтальной коры. Беговая дорожка в PHM значительно улучшила интернализацию рецепторов 5-HT2A и нейроны префронтальной коры мыши.
Количественная оценка интернализованных и связанных с мембраной положительных областей рецептора 5-HT2A относительно новой и положительной области подтвердила это наблюдение. Иммуноокрашивание и количественная оценка экспрессии c-Fos в положительных нейронах рецептора 5-HT2A показали, что беговая дорожка в PHM снижает регуляцию экспрессии c-Fos, индуцированной 5-HTP. Это последующее клеточное событие активации рецептора 5-HT2A и нейронов PFC мыши.
Механическое вмешательство может быть применено к частям тела, отличным от головы, для исследования механических аспектов эффектов упражнений.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Это исследование изучает, как физическая нагрузка, в частности бег на беговой дорожке, влияет на гомеостаз организма с помощью недавно разработанной системы пассивного движения головы (PHM). Имитируя механические ускорения, получаемые крысами, протокол эффективно выделяет механические факторы и их конкретное влияние на функции мозга.
Ключевые компоненты исследования
Область исследования
- Физическая нагрузка и гомеостаз
- Нейробиология механотрансдукции
- Влияние механических факторов на сигнальные пути мозга
Бакграунд
- Роль физической активности в физиологической регуляции
- Механические воздействия на нейронные реакции
- Важность понимания реакции мозга на физическую нагрузку
Использованные методы
- Специально разработанная система пассивного движения головы (PHM)
- Грызуны (крысы и мыши) в качестве биологических моделей
- Флуоресцентное окрашивание и иммуногистохимия для анализа мозга
Основные результаты
- PHM значительно ослабил реакцию подергивания головы у мышей
- Усиленная интернализация рецепторов 5-HT2A в нейронах префронтальной коры
- Подавление экспрессии c-Fos после механического вмешательства
Выводы
- Исследование демонстрирует валидный метод исследования механического влияния на мозг.
- Результаты способствуют более глубокому пониманию физиологии физических упражнений и нейронной передачи сигналов.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Dissecting the direct mechanical effects of exercise on brain signaling is critical for de-risking neurobiological targets and clarifying mechanistic hypotheses in early discovery. The passive head motion (PHM) system enables controlled, reproducible delivery of defined mechanical accelerations to rodent heads, supporting predictive confidence in mechanotransduction studies. This capability informs target validation and translational continuity for neuropsychiatric and exercise-related therapeutic programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mechanotransduction pathways implicated in exercise-induced brain homeostasis.
- Supports functional validation of serotonin receptor signaling in defined neuronal populations.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating mechanical from systemic exercise effects.
- Provides quantitative benchmarks for pathway activation and receptor internalization.
Screening & Assay Development
- Prepares validated rodent models for downstream neuropharmacological screening.
- Standardizes mechanical stimulation parameters for reproducible assay development.
- Generates quantitative outputs such as head acceleration profiles and receptor localization metrics.
- Enables reliable evaluation of compound effects on mechanosensitive pathways.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with disease-relevant mechanical stimuli observed in human exercise.
- Supports continuity from mechanistic discovery to biomarker-driven preclinical validation.
- Informs risk-adjusted advancement of neuropsychiatric and exercise-mimetic candidates.
- Provides a platform for evaluating translational biomarkers of mechanotransduction.
Pipeline & Workflow Integration
The PHM system integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven testing of mechanical signaling in rodent models, supporting both target validation and translational biomarker development.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing for mechanical activation of brain signaling pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative mechanical stimulation for assay standardization.
- Analytics: Provides measurable outputs such as acceleration profiles, receptor internalization, and c-Fos expression.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to preclinical models relevant for exercise and neuropsychiatric research.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse mechanotransduction and neurobiology studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in mechanistic hypotheses and target validation.
- Operational Value: Enables standardized, scalable, and reproducible mechanical stimulation protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by clarifying direct mechanical effects on brain targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neuropsychiatric and exercise-mimetic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent handling, neurobiology, and quantitative imaging.
- Needs instrumentation for controlled mechanical stimulation and high-resolution fluorescence microscopy.
- Demands cross-team standardization of stimulation parameters and analytical endpoints.
- Adaptation across rodent species and exercise paradigms may require protocol optimization.
- Mechanical intervention is limited to accessible body regions and may not fully recapitulate systemic exercise effects.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:35
Measurement of Magnitudes of Accelerations and Adjustment of the PHM System
1:33
Quantification of Mouse Head-Twitch Response
2:03
Immunohistochemical Analysis of Prefrontal Cortex (PFC) Collected from Euthanized Mouse Brain
3:22
Results: Effect of Treadmill Running and PHM Application in Mouse PFC Neurons
4:37
Conclusion
