Применение пассивного движения головы для генерации определенных ускорений на головах грызунов
21 июля 2022 г.
Настоящий протокол описывает специально разработанную систему «пассивного движения головы», которая воспроизводит механические ускорения на головах грызунов, генерируемые во время беговой дорожки с умеренными скоростями. Это позволяет препарировать механические факторы / элементы от благотворного воздействия физических упражнений.
Наш протокол помогает ответить на вопросы о том, как физические упражнения поддерживают гомеостаз организма. Системы позволили нам препарировать прямое механическое воздействие на мозг от сложных последствий физических нагрузок, таких как ходьба и бег трусцой. Для начала закрепите акселерометр поверх головы крысы с помощью хирургической ленты.
После полного восстановления после анестезии поместите крысу в тренажер беговой дорожки. Отрегулируйте беговую дорожку до умеренной скорости в 20 метров в минуту. Используйте прикладное программное обеспечение для измерения величины вертикальных ускорений вдоль осей X, Y и Z, когда крыса работает на беговой дорожке.
Сопоставьте значения, полученные от программного обеспечения, с величиной в частоте вертикального ускорения в системе PHM. Предустановлена амплитуда колебаний платформы и скорость вращения кулачка пропеллера. Затем поместите мышь в положение лежа с головой, расположенной на колеблющейся, а остальной частью тела на статических платформах.
Включите двигатель, чтобы колебать платформу вертикально и применить PHM к мыши. В прозрачном пластиковом корпусе настройте видеокамеру со скоростью кадров 24 FPS для записи всего пространства. Затем внутрибрюшинно вводят мышь пять гидрокситриптофана.
Поместите мышь в прозрачную клетку и начните запись в течение 30 минут. Просмотрите записанное видео на скорости 0,5x и подсчитайте подергивание головы вручную. Извлеките криосекции мозга мыши из слайд-бокса.
Оставьте слайды на чистых салфетках при комнатной температуре до тех пор, пока образцы полностью не обезвоживаются. Используйте ручку блокатора жидкости, чтобы нарисовать круг вокруг криосекционной ткани. Затем добавьте раствор TBS-T.
На дно лотка поместите влажные салфетки, чтобы создать влажную среду для горок. После пермеабляции TBS-T добавляют 4% ослиную сыворотку для блокировки и инкубируют при комнатной температуре в течение одного часа. Промойте слайды один раз, погрузившись в TBS-T на пять минут.
Затем нанесите 100 микролитров соответствующим образом разбавленного первичного антитела и смеси dappy на каждый слайд. Накройте лоток и высиживайте при комнатной температуре на ночь. После инкубации промыть TBS-T трижды в течение пяти минут каждый.
Применяют 100 микролитров соответствующим образом разбавленных видов флуоресцентных вторичных антител и инкубируют при комнатной температуре в течение одного часа. Послеполаскивайте TBS-T трижды в течение пяти минут каждая, монтируйте горки монтажным носителем и накрываете горки крышкой. После монтажа просмотрите образец под флуоресцентным микроскопом.
Система PHM была скорректирована для получения пиков вертикального ускорения примерно в 1,0 раза больше G, что было эквивалентно головам крыс во время бега на беговой дорожке. Применение PHM к мышам значительно ослабило их реакцию на подергивание головы по сравнению с контрольными мышами, представляющими супрессивный эффект PHM на передачу сигналов рецептора 5-HT2A в нейронах префронтальной коры. Беговая дорожка в PHM значительно улучшила интернализацию рецепторов 5-HT2A и нейроны префронтальной коры мыши.
Количественная оценка интернализованных и связанных с мембраной положительных областей рецептора 5-HT2A относительно новой и положительной области подтвердила это наблюдение. Иммуноокрашивание и количественная оценка экспрессии c-Fos в положительных нейронах рецептора 5-HT2A показали, что беговая дорожка в PHM снижает регуляцию экспрессии c-Fos, индуцированной 5-HTP. Это последующее клеточное событие активации рецептора 5-HT2A и нейронов PFC мыши.
Механическое вмешательство может быть применено к частям тела, отличным от головы, для исследования механических аспектов эффектов упражнений.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучается влияние физических упражнений, а именно бега на беговой дорожке, на гомеостаз организма с помощью недавно разработанной системы пассивного движения головы (PHM). Путем имитации механических ускорений, которые испытывают крысы, данный протокол позволяет эффективно изолировать механические факторы и их специфическое воздействие на функции мозга.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Физические упражнения и гомеостаз
- Нейробиология механотрансдукции
- Влияние механических факторов на сигнальные пути головного мозга
Теоретические основы
- Роль физической активности в физиологической регуляции
- Механическое воздействие на нейронные ответы
- Важность понимания реакции мозга на физические упражнения
Используемые методы
- Специально разработанная система пассивного движения головы (PHM)
- Грызуны (крысы и мыши) в качестве биологических моделей
- Флуоресцентное окрашивание и иммуногистохимия для анализа мозга
Основные результаты
- PHM значительно ослаблял реакцию подергивания головы у мышей
- Усиление интернализации рецепторов 5-HT2A в нейронах префронтальной коры
- Снижение экспрессии c-Fos после механического воздействия
Выводы
- Данное исследование демонстрирует надежный метод изучения механического воздействия на мозг.
- Полученные результаты способствуют более глубокому пониманию физиологии упражнений и нейронной передачи сигналов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Анализ прямого механического воздействия физических упражнений на передачу сигналов в мозге имеет решающее значение для снижения рисков при выборе нейробиологических мишеней и уточнения механистических гипотез на ранних этапах поиска. Система пассивного движения головы (PHM) обеспечивает контролируемую и воспроизводимую подачу заданных механических ускорений на головы грызунов, что повышает прогностическую достоверность исследований механотрансдукции. Эта возможность способствует валидации мишеней и обеспечивает трансляционную преемственность программ терапии нейропсихиатрических и связанных с физической активностью заболеваний.
Стратегические области применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать пути механотрансдукции, участвующие в гомеостазе мозга, индуцированном физической нагрузкой.
- Обеспечивает функциональную валидацию сигналинга серотониновых рецепторов в определенных популяциях нейронов.
- Способствует механистическому снижению рисков путем отделения механических эффектов от системных эффектов физической нагрузки.
- Предоставляет количественные показатели активации путей и интернализации рецепторов.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных моделей грызунов для последующего нейрофармакологического скрининга.
- Стандартизация параметров механической стимуляции для разработки воспроизводимого анализа.
- Получение количественных данных, таких как профили ускорения головы и показатели локализации рецепторов.
- Обеспечение надежной оценки влияния соединений на механочувствительные пути.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет доклинические модели с релевантными для заболевания механическими стимулами, наблюдаемыми при физических нагрузках у людей.
- Обеспечивает преемственность от выявления механизмов к доклинической валидации на основе биомаркеров.
- Служит основой для обоснованного с учетом рисков продвижения кандидатов в группу нейропсихиатрических препаратов и миметиков физических упражнений.
- Предоставляет платформу для оценки трансляционных биомаркеров механотрансдукции.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Система PHM интегрируется в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, обеспечивая возможность проверки гипотез о механической передаче сигналов на моделях грызунов, что способствует как валидации мишеней, так и разработке трансляционных биомаркеров.
- Фундаментальная биология: позволяет проверять нулевую гипотезу при изучении механической активации сигнальных путей мозга.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимую количественную механическую стимуляцию для стандартизации анализа.
- Аналитика: предоставляет измеримые показатели, такие как профили ускорения, интернализация рецепторов и экспрессия c-Fos.
- Трансляционные исследования: связывает данные о механизмах действия с доклиническими моделями, актуальными для исследований физических упражнений и нейропсихиатрических расстройств.
- Корпоративное повторное использование: представляет собой универсальную платформу для различных исследований в области механотрансдукции и нейробиологии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность механистических гипотез и валидацию мишеней.
- Практическая ценность: Обеспечивает возможность применения стандартизированных, масштабируемых и воспроизводимых протоколов механической стимуляции.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет уточнения прямых механических воздействий на мишени в головном мозге.
- Влияние на портфель проектов: Поддерживает приоритезацию нейропсихиатрических и миметических программ физических упражнений с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с грызунами, знания в области нейробиологии и количественной визуализации.
- Необходимо оборудование для контролируемой механической стимуляции и флуоресцентная микроскопия высокого разрешения.
- Требуется межкомандная стандартизация параметров стимуляции и аналитических конечных точек.
- Адаптация для различных видов грызунов и парадигм физических упражнений может потребовать оптимизации протокола.
- Механическое воздействие ограничено доступными областями тела и может не в полной мере воспроизводить системные эффекты физических упражнений.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:35
Measurement of Magnitudes of Accelerations and Adjustment of the PHM System
1:33
Quantification of Mouse Head-Twitch Response
2:03
Immunohistochemical Analysis of Prefrontal Cortex (PFC) Collected from Euthanized Mouse Brain
3:22
Results: Effect of Treadmill Running and PHM Application in Mouse PFC Neurons
4:37
Conclusion
