Выделение первичных клеток гладкой мускулатуры аорты, специфичных для пациента, и полуколичественные измерения сокращения в режиме реального времени in vitro

Этот метод позволяет исследователям изучать клеточное сокращение нескольких клеточных линий пациента одновременно. Это позволяет нам изучать болезни быстрее и эффективнее. Этот метод позволяет нам количественно оценивать сокращение клеток в режиме реального времени.

В течение часа мы можем получить значения сокращения десятков клеток. Мы впервые продемонстрировали, что сокращение мышечных клеток уменьшается в группе пациентов с аневризмами аорты. Это может быть новый биомаркер или мишень для медикаментозной терапии.

Начните со стерилизации двух пар хирургических щипцов и скальпеля, погружая их в 70% этанол и впоследствии вытирая их насухо. Затем пипетку двумя миллилитрами среды SMC в чашку Петри, в которой будет выполнено рассечение тканей. Далее пипетка 2,5 миллилитра среды SMC в две колбы Т-25.

Закрутите колбы вокруг так, чтобы небольшой объем среды покрывал всю поверхность. Визуально осмотрите биопсию, выявив три слоя аорты по наличию атеросклеротических бляшек на стороне интимы и слизистой соединительной ткани на адвентициальной стороне, чтобы различить слои. Чтобы изолировать SMC от среды, удалите два других слоя, сначала поместив ткань с интимной бляшкой вверх, затем удалите твердую бляшку, оттягивая ее от ткани щипцами, одновременно толкая ткань вниз второй парой щипцов, пока не будет виден розовый однородный медиальный слой.

Теперь переверните ткань и повторите ту же процедуру, стянув адвентивный слой, обязательно удалив все видимые части за столько попыток, сколько необходимо, так как этот слой не будет легко отделяться от среды. После того, как слой среды изолирован, разрежьте ткань на кубики, прижав среду щипцами и разрезав ткань в одном направлении с помощью скальпеля, делая чистые однонаправленные разрезы, чтобы свести к минимуму повреждение. Поместите от 10 до 20 из этих кусочков ткани в верхнюю четверть зенитки Т-25 с помощью щипцов.

После стерилизации двух пар хирургических щипцов и скальпеля, как описано ранее, пипетка двумя миллилитрами фибробластной среды в чашку Петри, в которой будет выполнено рассечение тканей. Затем пипетку 2,5 миллилитра фибробластной среды в две колбы Т-25 и закрутите колбы вокруг так, чтобы небольшой объем среды покрыл всю поверхность. Визуально осмотрите биопсию на предмет выявления эпидермиса с узнаваемой поверхностью кожи, иногда с видимыми волосами, затем ищите желтый и слизистый подкожный жир на противоположной стороне.

Слоем между эпидермисом и подкожно-жировой клетчаткой является дерма, источник жизнеспособных фибробластов. Чтобы изолировать фибробласты из дермы, удалите два других слоя, поместив ткань на сторону дермы, чтобы сделать все три слоя видимыми. Затем зажмите ткань щипцами и отрежьте весь эпидермис одной чистой линией, не повредив ткань.

Теперь переверните ткань и повторите ту же процедуру, разрезав внутри дермы параллельную границе с подкожно-жировой клетчаткой. После того, как дерма выделена, разрежьте ткань на кубики, прижимая ткань щипцами и разрезая ткань в одном направлении с помощью скальпеля. Затем поместите от 10 до 20 таких кусочков ткани в верхнюю четверть колбы Т-25 с помощью щипцов.

Подсчитайте ячейки с помощью автоматизированного счетчика клеток и засейте SMC в трипликат при плотности посева 30 000 клеток на лунку в 200 микролитрах среды SMC в желатиновой пластине ECIS. Поместите пластину с SMC в 96-луночный держатель ECIS в инкубаторе клеточных культур. Дважды щелкните программное обеспечение ECIS Applied BioPhysics, чтобы открыть программу, и нажмите кнопку Setup.

Проверьте, все ли электроды имеют контакт с держателем в левой нижней панели с маркировкой Well Configuration. Если электроды не подключены должным образом, отрегулируйте пластину в держателе перед началом измерения. Теперь выберите тип пластины на той же панели, щелкнув Тип массива.

Далее подготовьте две пипетки, установленные на два микролитра и объем 150 микролитров. Перед началом стимуляции нажмите Mark в программном обеспечении и поместите комментарий. Чтобы стимулировать клетки, снимите крышку и поместите ее на стерильную поверхность внутри инкубатора.

Затем индуцируют сокращение SMC путем пипетирования двух микролитров рабочего раствора иономицина в каждую лунку как можно быстрее. После того, как все клетки будут стимулированы, смешайте среду в лунках, используя вторую пипетку. Для определения воспроизводимости межэкспериментальных измерений два независимых измерения всех включенных контрольных и пациентских клеточных линий были построены в виде графика Блэнда-Альтмана, демонстрируя, что этот метод не показал изменчивости за пределами доверительного интервала, за исключением одной выделяющейся клеточной линии.

Две скважины, засеянные одним и тем же экспериментом и стимулируемые одновременно, показали практически одинаковую контрактную кривую отклика. Для проверки того, был ли показанный ответ сокращением, а не осмотическим стрессом из-за стимуляции иономицином, среда была заменена после стимуляции и было записано поведение клеток, что показало, что стимулированные клетки снова начали распространяться по электроду. Сократительный ответ в SMC, полученный из здоровой, недилатационной аорты, показал медианный ответ 61% по сравнению со средним ответом 52% у пациентов с аневризмой брюшной аорты.

Средний сократительный ответ контрольной группы был использован для выявления четырех пациентов, которые имели более низкие значения сокращения, чем нормальные значения. Анализ вестерн-блоттинга и последующая количественная оценка подтвердили, что клетки экспрессируют маркеры SMC. Для определения пролиферативной способности SMC для Ki67 была выполнена qPCR.

Экспрессия Ki67 обнаруживалась во всех клетках, но не коррелировала с сократительным выходом. Стимулируя клетки к сокращению, помните, чтобы не пипетировать слишком много лунок одновременно и старались пипетировать как можно быстрее. Эта процедура может потребовать некоторой практики.

Используя этот метод, мы разделили пациентов на основе их сокращения и снижения нормального сокращения, что позволило нам исследовать этих пациентов и связи с их клиническими характеристиками, такими как курение.