Простой микрофлюидный чип для долгосрочного роста и визуализации Caenorhabditis elegans

Основным преимуществом этой техники является то, что животное может свободно расти внутри устройства и может быть поймано в ловушку для изображения с высоким разрешением. Устройство может быть повторно использовано несколько раз. При изготовлении устройства чистота является наиболее важным фактором, чтобы иметь возможность изготовить пылевые устройства, чтобы избежать утечки во время работы устройства.

Начать проектирование шаблона один для слоя потока и шаблон два для контрольного слоя с использованием прямоугольных форм в программном обеспечении для обработки текста и печать фотомаск с помощью лазерного плоттера с минимальным размером объекта восемь микрометров на пленке на основе полиэстера. Нарежьте кремниевые пластины на квадратные кусочки высотой 2,5 сантиметра и шириной. Очистите их 20%-ным гидроксидом калия в течение одной минуты и промойте пластины в деионизированной воде.

Используйте одну пластину для потока, а другую для контрольного слоя. Высушите кусочки 14 P-S-I сжатым газообразным азотом с последующим обезвоживанием на конфорке при 120 градусах Цельсия в течение четырех часов. После охлаждения возьмите один кусок кремния, положите его на патрон спин-кодера и включите вакуум, чтобы удерживать пластину на месте.

Нанесите приблизительно 20 микролитров гексаметилдисилана на кусок кремния и покройте его с помощью спинового кодера при 500 R-P-M в течение пяти секунд, а затем 3000 R-P-M в течение 30 секунд. Чтобы получить однородную толщину фоторезиста приблизительно 40 микрометров, специфичную для слоя потока, покройте кремниевую пластину примерно 1,5 миллилитрами отрицательного фоторезиста с помощью спинового кодера при 500 R-P-M в течение пяти секунд, а затем 2000 R-P-M в течение 30 секунд. Повторите покрытие кремниевого куска гексаметилдисиланом и отрицательным фоторезистом один для второй пластины, чтобы получить однородную толщину фоторезиста приблизительно 40 микрометров, специфичную для контрольного слоя.

В качестве альтернативы, чтобы увеличить толщину проточного слоя примерно до 80 микрометров, для пожилых животных покрывают кремниевые пластины примерно 1,5 миллилитрами отрицательного фоторезиста два, используя спиновый кодер при 500 R-P-M в течение пяти секунд с последующим 2000 R-P-M в течение 30 секунд. Выпекайте оба ранее покрытых фоторезистом силиконовые кусочки на горячей плите при 65 градусах Цельсия в течение одной минуты, а затем 95 градусов Цельсия в течение 10 минут. После охлаждения поместите мягкие обожженные силиконовые кусочки на стадию экспозиции U-V осветителя с поверхностью с покрытием фоторезиста, обращенной к U-V лампе.

Подвергайте две части отдельно U-V в течение 15 секунд с помощью лампы мощностью 200 Вт через фотомаску с узорами один и два, чтобы получить слои потока и управления соответственно. Выпекайте два открытых силиконовых кусочка, как описано ранее, с покрытыми слоями, обращенными вверх. После охлаждения деталей разработайте узоры, замочив силиконовые кусочки в решении разработчика фоторезиста в течение 20 минут.

Как только рисунок будет виден, промойте кусочки чистым изопропиловым спиртом и осторожно высушите феном с использованием газообразного азота. Держите силиконовые кусочки в осушителе с покрытой поверхностью вверх. Подвергайте куски воздействию силановых паров, наливая 50 микролитров чистого T-C-P-F-O-S на стеклянную горку.

Поместите горку внутрь осушителя и высиживайте в течение двух часов. Сделайте P-D-M-S в пластиковом стаканчике, смешав эластомерную основу с отверждающим агентом и постоянно перемешивая в течение трех минут. Дегазируйте смесь P-D-M-S в адсорбаторе в течение 30 минут, чтобы удалить все пузырьки воздуха.

Поместите контрольный слой кремниевых пластин в чашку Петри и вылейте слой смеси P-D-M-S толщиной пять миллиметров на кусочки кремния. После процесса заливки P-D-M-S повторите дегазацию смеси P-D-M-S. Поместите кремниевую пластину с проточным слоем лицом к спиннеру, применяя вакуумное давление от 200 до 500 миллиторров.

Налейте примерно один миллилитр P-D-M-S на кремниевую пластину. Кодируйте его с помощью спин-коатера, чтобы получить слой толщиной около 80 микрометров. Выпекайте две кремниевые пластины со спин-покрытием P-D-M-S и разливайте слои P-D-M-S при 50 градусах Цельсия в конвекционной печи горячего воздуха в течение шести часов.

После охлаждения куски отрежут слой P-D-M-S толщиной пять миллиметров от кремниевого куска вокруг контрольного слоя с помощью острого лезвия и отклейте его от кремниевой подложки. Пробите два отверстия диаметром около одного миллиметра с помощью перфоратора Harris в резервуаре блока P-D-M-S для подключения иммобилизационного канала и входов изоляционного канала к газовым линиям для прогибов мембраны P-D-M-S. Поместите силиконовый кусок со слоем P-D-M-S со спин-покрытием на первый рисунок с поверхностью с покрытием P-D-M-S, обращенной вверх на пластиковый лоток.

Держите перфорированный блок P-D-M-S с рисунком два на лотке с формованной стороной вверх. Держите пластиковый лоток внутри плазмоочистителя и подвергайте две поверхности P-D-M-S воздействию воздушной плазмы мощностью 18 Вт в течение двух минут, применяя низкий вакуум. Выньте два обработанных плазмой блока и аккуратно свяжите блоки, прижав обработанные плазмой поверхности узоров один и два вместе.

Выпекайте связанные узоры при температуре 50 градусов Цельсия в течение двух часов в конвекционной печи горячего воздуха. Вынув склеенное устройство из печи, вырежьте его из кремниевой пластины с рисунком один и рисунком два и пробьете отверстия во входном и выходном резервуарах проточного слоя с помощью перфоратора Harris. Поместите склеенный блок P-D-M-S с проточным слоем, обращенным вверх, на пластиковый лоток и держите чистое покровное стекло на том же лотке.

Подвергайте блоки в покровном стекле воздействию 18 Вт воздушной плазмы в течение двух минут. Отрегулируйте вакуумное давление, чтобы увидеть фиолетовую камеру. Поместите плазменный блок P-D-M-S на покровное стекло и выпекайте склеенную структуру в духовке при 50 градусах Цельсия в течение двух часов.

Храните устройство в чистой камере для любого будущего эксперимента. Возьмите прибор, поставьте его на стереомикроскоп и прикрепите трубки. Подключите микрофлексную трубку к газовой линии сжатого азота и трехстороннему разъему на другом конце.

Соедините трубки одного и двух из трехходовых соединителей с ловушкой в изоляционных мембранах соответственно. Подключите две микрофлексные трубки к двум выходным портам трехстороннего запорного крана. Соедините другой конец двух трубок с восьмимиллиметровой иглой 18 калибра.

Заполните слой потока буфером M-9 с помощью микропипетки через входной порт. Заполните обе трубки деионизированной водой через конец, соединенный с иглой. Вставьте две иглы в перфорированные отверстия, соединяющие изолирующую и улавливающую мембрану.

Откройте регулятор газообразного азота на 14 P-S-I и поверните трехсторонний клапан из трубчатого, чтобы протолкнуть воду в устройство через микрофлюидные каналы в слоях управления, а именно мембраны ловушки и изоляции. Снимите давление с помощью трехстороннего запорного крана, как только каналы будут заполнены водой и загрунтованы. Удалите пузырьки, протолкнув дополнительную среду через канал потока.

На рисунке показаны изображения P-S-3-2-3-9, животного, растущего внутри микрофлюидного чипа и обездвиженного каждые восемь-10 часов для захвата флуоресцентных изображений. Вариация паттерна экспрессии представляет собой пример регуляции временных генов, когда один и тот же ген экспрессируется в разных клетках на разных стадиях развития. Визуализация индивидуального W-D-I-S-5-1 генотипа caenorhabditis elegans показывает менорообразную разветвленную дендритную архитектуру в каждом нейроне P-V-D, включающем первичные, вторичные третичные и четвертичные процессы на стадиях развития L-2, Late L-2, L-3 и L-4 соответственно.

На рисунке здесь сравниваются P-V-D разработки и выращенные устройством животные, а также животные, выращенные на пластинах N-G-M. Количество S-P и Q-P на разных стадиях развития червя увеличивалось с возрастом. Caenorhabditis elegans лечили каплей трех миллимолярного левамизола, чтобы вызвать достаточный паралич, необходимый для визуализации с высоким разрешением.

Значения S-P существенно не отличались при измерении у аналогичных стадийных животных, выращенных на пластинах N-G-M и изображенных с использованием трех миллимоляров левамизола на агаровом слайде. Кроме того, расстояние между двумя телами клеток P-V-C, одно из которых присутствует в хвосте, а второе вблизи вульвы, увеличивается по мере того, как они раздвигаются как у животных, выращенных в устройстве, так и у животных, выращенных на пластинах N-G-M. Рисунок представляет собой изображение нейронов сенсорных рецепторов высокого разрешения от животных, растущих внутри микрофлюидного устройства.

Монтаж представляет весь нейронный процесс P-L-M-R в последовательных точках времени, выделяя митохондрии и нейронный процесс. График представляет собой общую длину нейронального процесса, которая, как наблюдалось, увеличивается с наклоном 10,4 микрометра в час. Микро-изготовленное устройство использует тонкую мембрану P-D-M-S, отклоняемую в присутствии газообразного азота высокого давления, для иммобилизации и удержания C-элеганцев на месте для визуализации с высоким разрешением.

Эта процедура может позволить продольные исследования клеточных и субклеточных процессов у С-элегансов, которые нуждаются в прерывистых наблюдениях в течение длительного периода времени.