DetectSyn: быстрый, непредвзятый флуоресцентный метод обнаружения изменений плотности синапсов
July 22nd, 2022
DetectSyn - это непредвзятый, быстрый флуоресцентный анализ, который измеряет изменения относительного числа синапсов (до- и постсинаптического взаимодействия) между методами лечения или болезненными состояниями. Этот метод использует технику бесконтактной лигации, которая может быть использована как в культивируемых нейронах, так и в фиксированной ткани.
DetectSyn использует преимущества технологии бесконтактного лигирования для быстрого выявления изменений в синапсах. Мы также предоставляем протокол для анализа результатов. Основным преимуществом DetectSyn является то, как быстро результаты могут быть получены в больших областях ткани, которые могут быть проанализированы.
Для начала осторожно удалите блокирующий раствор пластиковой пипеткой Пастера, не нарушая клетки. Затем выровняйте большую пластиковую чашку Петри Парафильмом. А с помощью щипцов аккуратно перенесите крышку скользящих на Парафильм.
Добавьте 60 микролитров раствора первичного антитела в верхнюю часть крышки, гарантируя, что раствор антител не прольется по бокам крышки. Чтобы обеспечить влажность и предотвратить высыхание образцов во время инкубации, добавьте сверхчистую воду в меньшую чашку Петри и аккуратно поместите чашку вокруг крышки. Затем накройте большую чашку Петри и инкубируйте культивируемые клетки в течение одного часа при комнатной температуре.
После инкубации с первичным антителом используйте щипцы, чтобы осторожно отстукивать раствор первичного антитела от крышки на бумажное полотенце и переносить крышку на их оригинальную 24-луночную пластину, заполненную 500 микролитрами PBS. Затем промывайте образцы PBS три раза в течение 10 минут каждый с легким перемешиванием на орбитальном шейкере. После последней стирки переложите крышку обратно в большую чашку Петри и добавьте 40 микролитров раствора вторичного антитела в верхнюю часть крышки.
Накройте чашку Петри и высиживайте образцы при температуре 37 градусов цельсия в течение одного часа. Для лигирования, удерживая лигазу на холодной блокаде, разбавьте лигазу от 1 до 40 с помощью лигационного бульона и сразу же добавьте 40 микролитров смеси лигазы в крышку слипов. Накройте чашку Петри и инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.
Для усиления разбавляют полимеразу 1280 на холодном блоке с помощью амплификационного запаса. Затем добавьте 40 микролитров смеси для усиления в крышку и инкубируйте образцы в течение 100 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем для монтажа опустите три микролитра монтажного носителя на слайд.
Отсоедините лишний буфер промывки от крышки и поместите крышку с ячейками вниз в монтажный носитель. Запечатайте боковые стороны небольшим количеством прозрачного лака для ногтей, чтобы удерживать крышку на месте. Для крепления нарезанной ткани аккуратно перенесите срез ткани на подготовленный слайд и уложите его ровно.
Затем опустите от 5 до 10 микролитров монтажной среды на срез ткани. Поместите стеклянную крышку поверх среза ткани и запечатайте крышку прозрачным лаком для ногтей, как показано ранее. Для цифровой визуализации с помощью конфокального микроскопа отрегулируйте коэффициент усиления, смещение и мощность лазера для каждого флуоресцентного канала, чтобы уменьшить фоновый шум и усилить флуоресцентный сигнал.
Убедитесь, что флуоресцентный сигнал не перенасыщен. Для нейронов культуры на вкладке ND Acquisition нажмите кнопку Сохранить в файл. Затем в разделе Обзор выберите файл для сохранения изображения и введите имя файла.
Затем на вкладке Z выберите параметр Симметричный режим, определяемый диапазоном. Установите фокус на лучшую двухплоскостную карту и нажмите кнопку Relative, чтобы установить эту фокальную плоскость в качестве середины z-стека. Затем установите диапазон в пять микрометров с одним шагом микрометра и установите флажок Закрыть активный затвор во время движения Z.
На вкладке Длина волны выберите имя оптической кнопки с ранее настроенными параметрами сбора в разделе Оптическая конфигурация и нажмите кнопку Выполнить сейчас. Для разрезанной ткани в меню «Получить» выберите «Сканировать большое изображение», затем под панелью захвата выберите оптическую кнопку с ранее настроенными параметрами сбора. Кроме того, выберите правильную цель на этой панели.
Затем под панелью области и окуляром используйте клавиши со стрелками, чтобы установить границы интересующей области или рентабельности инвестиций. Затем нажмите «Сохранить большое изображение в файл» и создайте имя файла пути к сохранению для изображения. Наконец, на панели настройки убедитесь, что установлен флажок Многоканальный захват.
Затем выберите имя оптической кнопки с ранее настроенными параметрами сбора данных в разделе Оптическая конфигурация. В ImageJ откройте параметр порогового значения, перейдя в меню изображения, щелкнув Настроить, а затем Порог. Выберите параметр «Темный фон», если изображение имеет темный фон.
Затем отрегулируйте верхнюю и нижнюю границы порога в соответствии с ранее определенными оптимизированными настройками порога и нажмите «Применить». Для культивируемых клеток используйте канал MAP2 и инструмент ROI свободной руки, чтобы нарисовать ROI для каждого нейрона, включая дендриты и сому. Для нарезанной ткани нарисуйте свободную окупаемость инвестиций в изображение среза, которая инкапсулирует интересующую область.
Затем получите область ROI, открыв меню «Анализ» и нажав «Мера». Чтобы определить количество пунт в каждом ROI, используйте автоматический инструмент обнаружения, такой как анализ частиц. В меню Анализируемые выберите Анализируемые частицы и определите диаметр размера пункты.
Затем в раскрывающемся меню «Показать» выберите опцию «Наложенные маски», затем отметьте опцию «Отображать результаты» и нажмите «ОК». Чтобы разделить количество пунт на область отдельной рентабельности инвестиций, скопируйте и вставьте результаты для каждого изображения из всплывающего окна результатов в электронную таблицу. Определите, из какого файла и выборки получены данные, и разделите площадь ROI на количество пунт.
Наконец, для нормализации результатов для контрольных образцов усредняют результаты по контрольным образцам и делят полученные результаты всех образцов на среднее значение контрольного образца. Агонист GABAB, баклофен, необходим для эффективности in vitro быстрого антидепрессанта Ro-256981. Увеличение образования синапсов демонстрируется увеличением белого пунта.
Без баклофена увеличения образования синапсов не наблюдается. In vivo внутрибрюшинное введение быстрого антидепрессанта приводит к увеличению образования синапсов по сравнению с физиологическим контролем. В то время как некоторые пунты появляются на изображениях технического контроля, они, как правило, не такого размера, как показано белой спецификацией по сравнению с большой пунтой на других панелях.
Кроме того, эти пунты находятся не в том же месте, как показывают некоторые пунты, появляющиеся в соме. DetectSyn может выявлять изменения синапсов из-за болезненного состояния или медикаментозного лечения. Этот метод может помочь дать представление о любой области исследований, которая изучает расстройства, влияющие на развитие или разрушение синапсов.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
DetectSyn - это быстрый флуоресцентный анализ, предназначенный для измерения изменений в вовлечении синапсе при различных видах лечения или состояниях заболевания. Используя технику проксимального лигирования, он может применяться как к культивированным нейронам, так и к фиксированной ткани.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Флуоресцентные анализы
Бэкграунд
- DetectSyn использует технологию проксимального лигирования анализа.
- Метод позволяет быстро определять изменения в синапсах.
- Он применим к большим участкам ткани.
- Предоставляется протокол для анализа результатов.
Цель исследования
- Измерить изменения в количестве синапсе при различных условиях.
- Предоставить быструю и непредвзятую оценку вовлечения синапсе.
- Способствовать исследованию биологии синапсе и связанных расстройств.
Используемые методы
- Технология проксимального лигирования анализа.
- Флуоресцентные методы визуализации.
- Применение к культивированным нейронам и фиксированной ткани.
- Протокол для анализа результатов.
Основные результаты
- DetectSyn предоставляет быстрые результаты.
- Он может эффективно анализировать большие области ткани.
- Изменения в вовлечении синапсе могут быть количественно оценены.
- Результаты могут дать информацию об эффектах лечения или состояниях заболевания.
Выводы
- DetectSyn является ценным инструментом для исследований в области нейробиологии.
- Он улучшает понимание изменений в синапсах.
- Скорость и эффективность метода являются значительными преимуществами.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
DetectSyn addresses a critical bottleneck in neuroscience drug discovery by enabling rapid, unbiased quantification of synapse density changes across large tissue areas. This capability supports target validation and mechanistic de-risking for CNS therapeutics, particularly in depression and neurodegenerative disease programs where synaptic integrity is a key biomarker. The method’s accessibility and scalability enhance translational continuity from in vitro models to preclinical tissue analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying pre- and postsynaptic protein juxtaposition as a direct readout of synapse formation or elimination.
- Operational Value: Provides functional target validation through unbiased detection of synaptic changes induced by disease states or drug activity.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantitative, representative data on synaptic density that correlates with circuit-level functional outcomes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline synapse density metrics in cultured neurons and fixed tissue.
- Reproducibility: Delivers standardized, quantitative puncta counts per unit area via threshold-based particle analysis, enabling reliable compound evaluation across experiments.
- Scalability: Facilitates high-content analysis of large tissue regions, increasing statistical power and reducing sampling bias compared to low-n electron microscopy approaches.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with synaptic pathology in models of major depressive disorder and Alzheimer’s disease, where synapse loss is a hallmark.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to ex vivo tissue analysis, supporting risk-adjusted advancement decisions through consistent synaptic density readouts.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypic effects involve actual synaptic remodeling versus indirect neuronal changes, improving target confidence.
Pipeline & Workflow Integration
DetectSyn fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, where synaptic density serves as a mechanistic biomarker of neuronal circuit integrity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by directly measuring synapse formation or elimination as a functional readout of target engagement.
- Screening: Enables assay readiness through quantitative, unbiased puncta detection that standardizes synaptic density measurements across multi-well formats.
- Analytics: Generates normalized synapse density values (puncta/area) relative to controls, providing a comparable metric for assessing treatment effects across conditions.
- Translational Research: Connects cultured neuron data to fixed tissue slices, preserving synaptic measurement continuity through preclinical validation stages.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability across neuroscience projects, reducing redundant method development and enabling cross-study data comparison.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity around synaptic effects of compounds or disease models.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through protocolized imaging, thresholding, and particle analysis steps accessible to most laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering early, biologically relevant synaptic data that de-risks later-stage investment in CNS programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on synaptic density changes, a translationally validated biomarker with relevance to MDD, Alzheimer’s, and other neuropsychiatric indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence, proximity ligation assay handling, and fluorescent microscopy optimization.
- Dependent on access to confocal imaging systems and image analysis tools like ImageJ for threshold-based puncta detection.
- Necessitates standardization of antibody pairs, incubation conditions, and ROI definition across users and sites for reproducible results.
- Adaptation to different model systems (e.g., primary neurons, iPSC-derived neurons, tissue slices) requires validation of antigen accessibility and signal-to-noise ratios.
- Practical limitations include dependency on specific pre- and postsynaptic protein targets and potential steric hindrance in dense neuropil, as noted in source material regarding puncta size and localization controls.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:34
Primary Antibody Incubation
1:29
Sample Washes, Secondary Antibody Incubation, Ligation, Amplification, and Mounting
3:49
Digital Imaging with a Confocal Microscope
5:49
Image Analysis
7:41
Results: Increased Synapse Formation by Rapid Antidepressants in the Presence of GABAB Agonists
8:42
Conclusion
