DetectSyn: быстрый, непредвзятый флуоресцентный метод обнаружения изменений плотности синапсов
22 июля 2022 г.
DetectSyn - это непредвзятый, быстрый флуоресцентный анализ, который измеряет изменения относительного числа синапсов (до- и постсинаптического взаимодействия) между методами лечения или болезненными состояниями. Этот метод использует технику бесконтактной лигации, которая может быть использована как в культивируемых нейронах, так и в фиксированной ткани.
DetectSyn использует преимущества технологии бесконтактного лигирования для быстрого выявления изменений в синапсах. Мы также предоставляем протокол для анализа результатов. Основным преимуществом DetectSyn является то, как быстро результаты могут быть получены в больших областях ткани, которые могут быть проанализированы.
Для начала осторожно удалите блокирующий раствор пластиковой пипеткой Пастера, не нарушая клетки. Затем выровняйте большую пластиковую чашку Петри Парафильмом. А с помощью щипцов аккуратно перенесите крышку скользящих на Парафильм.
Добавьте 60 микролитров раствора первичного антитела в верхнюю часть крышки, гарантируя, что раствор антител не прольется по бокам крышки. Чтобы обеспечить влажность и предотвратить высыхание образцов во время инкубации, добавьте сверхчистую воду в меньшую чашку Петри и аккуратно поместите чашку вокруг крышки. Затем накройте большую чашку Петри и инкубируйте культивируемые клетки в течение одного часа при комнатной температуре.
После инкубации с первичным антителом используйте щипцы, чтобы осторожно отстукивать раствор первичного антитела от крышки на бумажное полотенце и переносить крышку на их оригинальную 24-луночную пластину, заполненную 500 микролитрами PBS. Затем промывайте образцы PBS три раза в течение 10 минут каждый с легким перемешиванием на орбитальном шейкере. После последней стирки переложите крышку обратно в большую чашку Петри и добавьте 40 микролитров раствора вторичного антитела в верхнюю часть крышки.
Накройте чашку Петри и высиживайте образцы при температуре 37 градусов цельсия в течение одного часа. Для лигирования, удерживая лигазу на холодной блокаде, разбавьте лигазу от 1 до 40 с помощью лигационного бульона и сразу же добавьте 40 микролитров смеси лигазы в крышку слипов. Накройте чашку Петри и инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.
Для усиления разбавляют полимеразу 1280 на холодном блоке с помощью амплификационного запаса. Затем добавьте 40 микролитров смеси для усиления в крышку и инкубируйте образцы в течение 100 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем для монтажа опустите три микролитра монтажного носителя на слайд.
Отсоедините лишний буфер промывки от крышки и поместите крышку с ячейками вниз в монтажный носитель. Запечатайте боковые стороны небольшим количеством прозрачного лака для ногтей, чтобы удерживать крышку на месте. Для крепления нарезанной ткани аккуратно перенесите срез ткани на подготовленный слайд и уложите его ровно.
Затем опустите от 5 до 10 микролитров монтажной среды на срез ткани. Поместите стеклянную крышку поверх среза ткани и запечатайте крышку прозрачным лаком для ногтей, как показано ранее. Для цифровой визуализации с помощью конфокального микроскопа отрегулируйте коэффициент усиления, смещение и мощность лазера для каждого флуоресцентного канала, чтобы уменьшить фоновый шум и усилить флуоресцентный сигнал.
Убедитесь, что флуоресцентный сигнал не перенасыщен. Для нейронов культуры на вкладке ND Acquisition нажмите кнопку Сохранить в файл. Затем в разделе Обзор выберите файл для сохранения изображения и введите имя файла.
Затем на вкладке Z выберите параметр Симметричный режим, определяемый диапазоном. Установите фокус на лучшую двухплоскостную карту и нажмите кнопку Relative, чтобы установить эту фокальную плоскость в качестве середины z-стека. Затем установите диапазон в пять микрометров с одним шагом микрометра и установите флажок Закрыть активный затвор во время движения Z.
На вкладке Длина волны выберите имя оптической кнопки с ранее настроенными параметрами сбора в разделе Оптическая конфигурация и нажмите кнопку Выполнить сейчас. Для разрезанной ткани в меню «Получить» выберите «Сканировать большое изображение», затем под панелью захвата выберите оптическую кнопку с ранее настроенными параметрами сбора. Кроме того, выберите правильную цель на этой панели.
Затем под панелью области и окуляром используйте клавиши со стрелками, чтобы установить границы интересующей области или рентабельности инвестиций. Затем нажмите «Сохранить большое изображение в файл» и создайте имя файла пути к сохранению для изображения. Наконец, на панели настройки убедитесь, что установлен флажок Многоканальный захват.
Затем выберите имя оптической кнопки с ранее настроенными параметрами сбора данных в разделе Оптическая конфигурация. В ImageJ откройте параметр порогового значения, перейдя в меню изображения, щелкнув Настроить, а затем Порог. Выберите параметр «Темный фон», если изображение имеет темный фон.
Затем отрегулируйте верхнюю и нижнюю границы порога в соответствии с ранее определенными оптимизированными настройками порога и нажмите «Применить». Для культивируемых клеток используйте канал MAP2 и инструмент ROI свободной руки, чтобы нарисовать ROI для каждого нейрона, включая дендриты и сому. Для нарезанной ткани нарисуйте свободную окупаемость инвестиций в изображение среза, которая инкапсулирует интересующую область.
Затем получите область ROI, открыв меню «Анализ» и нажав «Мера». Чтобы определить количество пунт в каждом ROI, используйте автоматический инструмент обнаружения, такой как анализ частиц. В меню Анализируемые выберите Анализируемые частицы и определите диаметр размера пункты.
Затем в раскрывающемся меню «Показать» выберите опцию «Наложенные маски», затем отметьте опцию «Отображать результаты» и нажмите «ОК». Чтобы разделить количество пунт на область отдельной рентабельности инвестиций, скопируйте и вставьте результаты для каждого изображения из всплывающего окна результатов в электронную таблицу. Определите, из какого файла и выборки получены данные, и разделите площадь ROI на количество пунт.
Наконец, для нормализации результатов для контрольных образцов усредняют результаты по контрольным образцам и делят полученные результаты всех образцов на среднее значение контрольного образца. Агонист GABAB, баклофен, необходим для эффективности in vitro быстрого антидепрессанта Ro-256981. Увеличение образования синапсов демонстрируется увеличением белого пунта.
Без баклофена увеличения образования синапсов не наблюдается. In vivo внутрибрюшинное введение быстрого антидепрессанта приводит к увеличению образования синапсов по сравнению с физиологическим контролем. В то время как некоторые пунты появляются на изображениях технического контроля, они, как правило, не такого размера, как показано белой спецификацией по сравнению с большой пунтой на других панелях.
Кроме того, эти пунты находятся не в том же месте, как показывают некоторые пунты, появляющиеся в соме. DetectSyn может выявлять изменения синапсов из-за болезненного состояния или медикаментозного лечения. Этот метод может помочь дать представление о любой области исследований, которая изучает расстройства, влияющие на развитие или разрушение синапсов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
DetectSyn представляет собой экспресс-метод флуоресцентного анализа, предназначенный для измерения изменений в формировании синаптических контактов при различных вариантах воздействия или патологических состояниях. Благодаря использованию метода лигации при сближении данный анализ может применяться как для культивируемых нейронов, так и для фиксированных тканей.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Флуоресцентный анализ
Теоретическая часть
- DetectSyn основан на технологии анализа проксимальной лигации.
- Данный метод позволяет быстро выявлять синаптические изменения.
- Он применим к обширным участкам ткани.
- Представлен протокол анализа результатов.
Цель исследования
- Для измерения изменений количества синапсов при различных условиях.
- Для обеспечения быстрой и объективной оценки синаптического взаимодействия.
- Для содействия исследованиям в области биологии синапсов и связанных с ними заболеваний.
Используемые методы
- Технология анализа лигации при сближении (Proximity ligation assay).
- Методы флуоресцентной визуализации.
- Применение к культурам нейронов и фиксированным тканям.
- Протокол анализа результатов.
Основные результаты
- DetectSyn обеспечивает быстрое получение результатов.
- Метод позволяет эффективно анализировать обширные области ткани.
- Можно количественно оценить изменения в синаптических контактах.
- Результаты могут дать информацию об эффектах лечения или состояниях заболевания.
Выводы
- DetectSyn является ценным инструментом для нейробиологических исследований.
- Он расширяет понимание синаптических изменений.
- Скорость и эффективность данного метода являются значительными преимуществами.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
DetectSyn решает критическую проблему в области поиска новых лекарственных средств для нейронаук, обеспечивая быстрое и объективное количественное определение изменений плотности синапсов на обширных участках ткани. Эта возможность способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков при разработке препаратов для терапии ЦНС, особенно в программах по лечению депрессии и нейродегенеративных заболеваний, где целостность синапсов является ключевым биомаркером. Доступность и масштабируемость данного метода улучшают трансляционную преемственность при переходе от моделей in vitro к преклиническому анализу тканей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественной оценки сближения пре- и постсинаптических белков в качестве прямого показателя формирования или элиминации синапсов.
- Операционная ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней посредством непредвзятого выявления синаптических изменений, вызванных патологическими состояниями или действием препаратов.
- Прогностическая ценность: способствует приоритизации портфеля разработок за счет получения количественных репрезентативных данных о плотности синапсов, которые коррелируют с функциональными исходами на уровне нейронных цепей.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга путем установления базовых показателей плотности синапсов в культивируемых нейронах и фиксированной ткани.
- Воспроизводимость: Обеспечение стандартизированного количественного подсчета пункт в единице площади с помощью анализа частиц на основе порога, что позволяет надежно оценивать соединения в различных экспериментах.
- Масштабируемость: Обеспечение высококонтентного анализа обширных областей ткани, что повышает статистическую значимость и снижает систематическую ошибку отбора проб по сравнению с методами электронной микроскопии с малым числом образцов (low-n).
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Соответствует синаптической патологии в моделях большого депрессивного расстройства и болезни Альцгеймера, где потеря синапсов является характерным признаком.
- Трансляционная преемственность: Связывает результаты исследований in vitro с анализом тканей ex vivo, что позволяет принимать обоснованные решения о дальнейшем продвижении с учетом рисков на основе согласованных показателей плотности синапсов.
- Механистическое снижение рисков: Позволяет выяснить, связаны ли наблюдаемые фенотипические эффекты с фактическим ремоделированием синапсов или с косвенными изменениями нейронов, что повышает уверенность в выбранной мишени.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
DetectSyn вписывается в континуум разработки лекарственных средств — от ранней валидации мишеней и идентификации соединений-лидеров до доклинических испытаний эффективности, где плотность синапсов служит механистическим биомаркером целостности нейронных цепей.
- Основополагающая биология: обеспечивает проверку гипотез и уточнение путей передачи сигналов путем прямого измерения формирования или элиминации синапсов в качестве функционального показателя взаимодействия с мишенью.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет количественного и объективного детектирования пунктообразных структур, что стандартизирует измерения плотности синапсов в многолуночных форматах.
- Аналитика: генерирует нормализованные значения плотности синапсов (пункты/площадь) относительно контрольных образцов, предоставляя сопоставимый показатель для оценки эффектов терапии при различных условиях.
- Трансляционные исследования: связывает данные по культивируемым нейронам с данными по фиксированным срезам тканей, обеспечивая непрерывность измерения синапсов на этапах доклинической валидации.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как многократно используемая платформа для различных проектов в области нейробиологии, сокращая избыточную разработку методов и позволяя сравнивать данные между разными исследованиями.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишени за счет снижения механистической неопределенности в отношении синаптических эффектов соединений или моделей заболеваний.
- Операционная ценность: Повышает уровень стандартизации и воспроизводимости благодаря протоколированным этапам визуализации, пороговой обработки и анализа частиц, доступным для большинства лабораторий.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go»), предоставляя ранние, биологически значимые данные о синапсах, что снижает риски последующих инвестиций в программы по ЦНС.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию с учетом рисков на основе изменений плотности синапсов — трансляционно валидированного биомаркера, актуального для БАР, болезни Альцгеймера и других нейропсихиатрических показаний.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с методами иммунофлуоресценции, проведением анализа лигации близости (proximity ligation assay) и оптимизацией флуоресцентной микроскопии.
- Метод зависит от наличия систем конфокальной визуализации и инструментов анализа изображений, таких как ImageJ, для обнаружения пунктат на основе пороговых значений.
- Для получения воспроизводимых результатов необходима стандартизация пар антител, условий инкубации и определения областей интереса (ROI) для всех пользователей и центров.
- Адаптация к различным модельным системам (например, первичным нейронам, нейронам, полученным из iPSC, срезам тканей) требует валидации доступности антигена и соотношения сигнал/шум.
- Практические ограничения включают зависимость от конкретных мишеней пре- и постсинаптических белков и возможные стерические затруднения в плотном нейропиле, как отмечено в исходных материалах относительно контроля размера и локализации пунктат.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:34
Primary Antibody Incubation
1:29
Sample Washes, Secondary Antibody Incubation, Ligation, Amplification, and Mounting
3:49
Digital Imaging with a Confocal Microscope
5:49
Image Analysis
7:41
Results: Increased Synapse Formation by Rapid Antidepressants in the Presence of GABAB Agonists
8:42
Conclusion
