Выделение специфических для клеток РНК из замороженных образцов гетерогенных тканей без сортировки клеток
8 декабря 2021 г.
Этот протокол направлен на изоляцию специфических для клеточного типа транслирующих рибосомных мРНК с использованием мышиной модели NuTRAP.
Этот протокол направлен на получение высококачественных специфических РНК типов клеток из небольшого количества клеток в сложной ткани без сортировки клеток. Он использует недавно доступную модель мыши, которая позволяет исследователям изолировать рибосомные связанные РНК с помощью GLP pull down. Метод также подходит для выделения рибосомных связанных РНК из любых EGFP-экспрессирующих клеток.
Для начала добавьте два миллилитра рабочего буфера гомогенизации ледяного холода в комплект измельчителя стеклянной ткани. Быстро поместите замороженный образец в мясорубку и гомогенизируйте ткань 30 ударами по льду с помощью рыхлого пестика. переложить гомогенат на двухмиллилитровую трубку с круглым дном и центрифугу по 12 000 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.
Затем перенесите супернатант в новую двухмиллилитровую трубку, не нарушая гранулу, резервируя 100 микролитров в качестве входных данных. Инкубируйте супернатант с антителом против GFP при четырех градусах Цельсия на конце торцевого ротатора в течение ночи. Переложите смесь гомогената и антител в новую двухмиллилитровую трубку с круглым дном, содержащую промытые белковые шарики g, и инкубировали четыре градуса Цельсия на ротаторе при 24 об/мин в течение двух часов.
Отделите магнитные шарики от супернатанта с помощью магнитной стойки. Сохраните супернатант как отрицательную фракцию, которая содержит РНК в отрицательных клетках EGFP и РНК в положительных клетках EGFP, которые не связаны с рибосомами. Добавьте один миллилитр буфера для промывки высокой соли в бусины и ненадолго вихрьте трубку, чтобы промыть бусины.
Затем поместите трубку в магнитную стойку. Удалите буфер промывки и повторите шаги промывки еще два раза, чтобы получить комплекс РНК рибосомы шариков из EGFP-положительных клеток. Инкубируйте шарики с 50 микролитрами экстракционного буфера из комплекта изоляции РНК в ThermoMixer в течение 30 минут, чтобы освободить РНК из шариков.
Отделите бусины с помощью магнитной стойки и перенесите супернатант в трубку объемом 1,5 миллилитра. Центрифугируйте пробирку по 3000 г в течение двух минут. Затем пипетку супернатанта в новую трубку объемом 1,5 миллилитра.
Чтобы предварительно кондиционировать колонну очистки РНК, пипетку 250 микролитров кондиционирующего буфера на очистительную колонну и инкубируют в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем центрифугируют колонну при 16 000 г в течение одной минуты. Пипетка равного объема 70% этанола в клеточный экстракт и хорошо перемешивается путем пипетки.
Пипетка до 200 микролитров смеси в предварительно кондиционированную колонку очистки РНК. Для уменьшения потерь образцов не заполняйте колонну более чем на 80% ее емкости. Повторяйте этот шаг несколько раз, пока все РНК не будут собраны в один столбец каждой фракции.
Центрифугируют колонну в течение двух минут, чтобы связать РНК с мембраной в колонке. Затем продолжайте центрифугирование в течение 30 секунд. Отбросьте поток и пипетку 100 микролитров промывочного буфера один в колонну.
Центрифугируйте в течение одной минуты, затем отбросьте поток насквозь. Пипетка 75 микролитров раствора ДНК смешивается непосредственно с мембраной колонки очистки. Инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут.
Затем пипетка 40 микролитров промывочного буфера один в колонну и центрифугу еще на 30 секунд. Отбросьте поток. Пипетка 100 микролитров промывки буфера два в колонну и центрифугу по 8 000 г в течение одной минуты.
Отбросьте поток. Купить ПЭТ 100 микролитров промывочного буфера два в колонну и центрифугу по 16 000 г в течение двух минут. Отбросьте поток и повторно центрифугируйте ту же колонну по 16 000 г в течение одной минуты, чтобы удалить все следы промывочного буфера.
Перенесите колонну на новую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку. пипетка 12 микролитров рваной воды непосредственно на мембрану очистительной колонны, гарантируя, что наконечник пипетки не коснется мембраны. Инкубировать при комнатной температуре в течение одной минуты и центрифугировать по 1000 г в течение одной минуты.
Затем при 16 000 G в течение одной минуты элюировать РНК. Используйте биоанализатор для оценки качества и количества экстрагированной РНК. Храните РНК в морозильной камере на 80 градусов или отправляйте на дальнейший анализ.
Мышам, несущим оба генно-инженерных аллеля генов, Gli1-CreERT2 и NuTRAP, нам вводят тамоксифен один раз в день, через день для трех инъекций. Иммунофлуоресцентный анализ собранных тканей показывает, что EGFP экспрессировался в интерстициальных клетках в яичках. EGFP также был обнаружен в капсульных клетках надпочечников у мышей Gli1-CreERT2, NuTRAP.
У мышей Sonic Hedgehog-CreERT2, NuTRAP Популяция EGFP-положительных клеток находится во внешней коре надпочечников под капсулой, подтверждая экспрессию EGFP предварительно экспрессирующих клеток. После экстракции специфических РНК клеточного типа экстрагированную РНК отправляли на анализ микрочипов. Результаты показали, что около 3000 генов были обогащены положительной фракцией, по сравнению с генами в отрицательной фракции, тогда как около 4000 генов были обогащены отрицательной фракцией.
Среди дифференциально экспрессированных генов клетки Лейдига гены Hsd11b1 и Hsd3b6 были обогащены положительной фракцией. В отрицательной фракции были обогащены связанные с клетками Сертоли гены Desert Hedgehog и Gstm6. Только несколько дифференциально экспрессированных генов были идентифицированы при сравнении отрицательной фракции с входом.
Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени использовалась для подтверждения экспрессии ключевых генов в положительных и отрицательных фракциях. Подобно тому, что было обнаружено в анализе микрочипов, стероидогенные ферменты 3-бета-гидроксистероиддегидрогеназа и фермент расщепления боковой цепи холестерина были обогащены положительной фракцией. Между тем, клеточный маркер Сертоли SRY бокс транскрипционный фактор девять и маркер зародышевых клеток синаптонемального комплексного белка три были обогащены отрицательной фракцией.
При попытке этого протокола важно приготовить свежий рабочий буфер гомогенизации Добавить DTT, циклогексимид рекомбинантную рибонуклеазу и коктейль ингибитора протеиназы в раствор гомогенизации только перед использованием. Также важно приготовить свежие буферы с низким содержанием соли и буферы для промывки с высоким содержанием соли перед использованием.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан метод выделения транслируемых рибосомальных мРНК, специфичных для определенных типов клеток, с использованием мышиной модели NuTRAP, что позволяет экстрагировать высококачественные РНК из малых популяций клеток без необходимости в сортинге клеток. Этот метод особенно полезен для изучения экспрессирующих EGFP клеток и идентификации дифференциально экспрессируемых генов, связанных со специфическими типами клеток.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Клеточная биология
- Молекулярная биология
Теоретическая часть
- Мышиная модель NuTRAP позволяет изолировать РНК, связанную с рибосомами.
- Данный подход позволяет избежать сложностей, связанных с сортировкой клеток в гетерогенных тканях.
Используемые методы
- GLP-осаждение для изоляции рибосом-связанной РНК
- Мышиная модель NuTRAP
- Микрочиповый анализ и ОТ-ПЦР для валидации экспрессии генов
Основные результаты
- Примерно 3000 генов были обогащены в положительной фракции РНК, в то время как 4000 генов были обогащены в отрицательной фракции.
- В соответствующих фракциях РНК были идентифицированы специфические гены, связанные с клетками Лейдига и клетками Сертоли.
- Гены ключевых ферментов продемонстрировали обогащение, согласующееся с результатами микрочипового анализа.
Выводы
- В исследовании продемонстрирован надежный метод выделения РНК конкретных типов клеток.
- Полученные результаты способствуют пониманию экспрессии генов в различных типах клеток семенников.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Выделение РНК специфических типов клеток из гетерогенных тканей без использования сортинга клеток позволяет решить ключевую проблему валидации мишеней и снижения механистических рисков. Метод NuTRAP на основе технологии TRAP обеспечивает воспроизводимое количественное транскриптомное профилирование определенных клеточных популяций, что повышает прогностическую уверенность на ранних этапах поиска. Данный подход снижает уровень биологического шума и улучшает трансляционную преемственность от этапа поиска до доклинической валидации.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы для конкретных типов клеток в сложных тканях.
- Практическая ценность: позволяет избежать артефактов, возникающих при сортировке клеток, сохраняя нативное состояние РНК для надежной валидации мишеней.
- Прогностическая ценность: способствует поиску биомаркеров и уточнению сигнальных путей в системах, релевантных для заболевания.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: получение стандартизированных образцов РНК, связанной с рибосомами, для последующей разработки анализов.
- Практическая ценность: обеспечение воспроизводимых количественных результатов, подходящих для подготовки к высокопроизводительному скринингу.
- Масштабируемость: совместимость с ограниченным количеством исходного материала, что позволяет повторно использовать метод в нескольких моделях, экспрессирующих EGFP.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Сохраняет релевантность патологического процесса за счет получения транскриптомов специфических типов клеток в контексте нативной ткани.
- Практическая ценность: Обеспечивает преемственность от этапа поиска до доклинической валидации благодаря использованию единого принципа изоляции РНК.
- Снижение рисков: Уменьшает механистическую неоднозначность при оценке взаимодействия с мишенью и анализе результатов фенотипического скрининга.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум открытий — от идентификации мишени до оптимизации соединений-лидеров, особенно в тех случаях, когда разрешение на уровне типов клеток имеет решающее значение для понимания механизмов. Он позволяет проводить проверку гипотез и снижение биологических рисков перед началом кампаний по скринингу соединений.
- Биологические исследования: обеспечивает точную проверку гипотез в гетерогенных тканях путем изоляции транслируемых РНК из определенных популяций клеток.
- Скрининг: позволяет получать стандартизированные пулы рибосом-ассоциированных РНК, подходящие для валидации анализа и проверки воспроизводимости.
- Аналитика: дает количественные данные об экспрессии генов (например, микрочипы, RT-PCR), которые позволяют проводить сравнение различных условий и определять приоритетные мишени.
- Трансляционные исследования: связывают ранние этапы открытий с доклинической работой за счет сохранения специфичных для конкретных типов клеток сигналов в сложных органах, таких как семенники и надпочечники.
- Повторное использование в масштабах предприятия: метод адаптируем для различных линий Cre-драйверов и NuTRAP, что делает его масштабируемой платформой для проведения омиксных исследований, специфичных для конкретных типов клеток.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность валидации мишеней за счет снижения влияния мешающих сигналов из гетерогенных тканей.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и стандартизацию между лабораториями благодаря использованию унифицированных этапов лизиса, иммунопреципитации (IP) и выделения РНК.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя более чистые и интерпретируемые транскриптомные данные для сортировки портфеля проектов.
- Влияние на портфель: Обеспечивает продвижение проектов с учетом рисков за счет изоляции истинных клеточно-специфических сигналов, что снижает количество ложных направлений при последующей валидации.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с тканями, методами иммунопреципитации и методами сохранения РНК.
- Необходим доступ к магнитным стойкам, термомиксерам, центрифугам и колонкам для очистки РНК.
- Требуется стандартная подготовка буферов (для гомогенизации, промывки, элюции) непосредственно перед использованием для предотвращения активности РНказ.
- При адаптации метода следует учитывать необходимость проверки уровней экспрессии EGFP и эффективности связывания рибосом в новых моделях с Cre-драйвером.
- Практические ограничения включают ограничения по количеству исходного материала ткани, а также необходимость оптимизации концентрации антител и магнитных частиц.
