Дрозофила меланогастер Протокол инжекции личинок
19 октября 2021 г.
Взрослые мухи Drosophila melanogaster широко использовались в качестве модельных организмов для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе врожденных иммунных реакций хозяина противомикробных препаратов и стратегий микробной инфекции. Для продвижения стадии личинки D. melanogaster в качестве дополнительной или альтернативной модельной системы описана методика личиночного впрыска.
Этот протокол решает трудности и проблемы с микроинъекцией личинки, описывая точный метод, который позволит использовать личинку Drosophila melanogaster в качестве модели для различных иммунных и молекулярных исследований. Это простая инъекционная техника, которая представляет собой эффективный, экономичный и быстрый метод многократной доставки различных веществ единообразным образом, что позволяет получать последовательные и надежные результаты. Начните с выбора личинок третьей стадии и мыть их раствором Рингера в небольшой чашке Петри.
Поместите фильтровальную бумагу в чашку Петри и смочите ее 5 мл раствора Рингера. Затем поместите личинки на фильтровальную бумагу. Подготовьте капилляры, используя 3,5-дюймовые стеклянные капиллярные трубки в съемнике микропипетки.
Откройте стеклянный капилляр с помощью прямых зазубренных среднеточечных щипцов. Наполните открытый капилляр минеральным маслом с помощью пластикового одноразового шприца. Затем выбросьте масло из капиллярной трубки с помощью нанолитрового инжектора.
Наполните капилляр нужным бактериальным препаратом для инъекций. Переложите обезболенные личинки на фильтровальную бумагу, смоченную раствором Рингера. С помощью щипцов оказывайте сильное давление на спинную сторону заднего конца личинок, где заметны дыхальца трахеи.
Затем вставьте иглу горизонтально, к заднему концу личинок, и введите бактериальные запасы. Удалите щипцы, чтобы избежать разлива гемолимфы или кишечника. Затем извлеките иглу, предварительно вставленную в личинки.
Заражайте 20 личинок для каждого экспериментального состояния. С помощью кисти аккуратно перенесите введенные личинки в отдельную влажную фильтровальную бумагу. Добавьте решение Рингера по мере необходимости, чтобы предотвратить высыхание.
Инкубировать чашку Петри в инкубаторе при 25 C.Личинки Drosophila melanogaster, инфицированные Photorhabdus asymbiotica, демонстрировали 57%-ную выживаемость в течение 24 часов после инъекции, в то время как личинки, введенные кишечной палочкой, показали 85% выживаемость в тот же момент времени. Важность этого метода заключается в том, что игла держится примерно параллельно личинке. Давление, прилагаемое для удержания личинки, очень мало, что снижает вероятность утечки гемолимфы, смертельной травмы или неадекватной доставки желаемого вещества.
Эта техника может быть усовершенствована с практикой.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается метод инъекций личинок Drosophila melanogaster, предназначенный для облегчения использования личинок в иммунологических и молекулярных исследованиях. Метод позволяет преодолеть трудности при микроинъекциях личинок и представляет собой надежный подход к доставке веществ.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Микробиология
- Иммунология
Теоретические основы
- Drosophila melanogaster является широко используемым модельным организмом.
- Понимание врожденных противомикробных иммунных ответов имеет решающее значение.
- Личиночные стадии позволяют глубже изучить стратегии микробной инфекции.
- Методы микроинъекций необходимы для обеспечения воспроизводимости экспериментов.
Цель исследования
- Продвижение личинок D. melanogaster в качестве модельной системы.
- Предоставление детального метода микроинъекций личинок.
- Повышение достоверности иммунологических и молекулярных исследований.
Используемые методы
- Отоберите личинок третьего возраста для инъекции.
- Промойте личинок раствором Рингера.
- Подготовьте капилляры, используя стеклянные капиллярные трубки.
- Равномерно введите вещества в личинок.
Основные результаты
- Данный метод обеспечивает эффективную доставку веществ.
- Результаты остаются стабильными и достоверными в различных экспериментах.
- Экономически выгодный метод, подходящий для различных исследований.
- Облегчает изучение иммунных ответов у личинок.
Выводы
- Метод инъекций в личинки является ценным инструментом для исследователей.
- Он расширяет возможности использования D. melanogaster в научных исследованиях.
- В будущих исследованиях этот метод может быть использован для получения более глубоких данных.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Личинки Drosophila melanogaster представляют собой экономически эффективную и генетически доступную модель для изучения врожденного иммунитета и взаимодействий между хозяином и патогеном, что позволяет проводить валидацию мишеней на ранних стадиях при снижении этической и финансовой нагрузки. Протокол инъекций личинкам повышает воспроизводимость анализов иммунного ответа, способствуя механистическому снижению рисков при разработке антимикробных и иммуномодулирующих кандидатов. Данный подход связывает фундаментальную биологию с доклинической оценкой, обеспечивая количественные показатели выживаемости и исходов инфекции в системе, релевантной для заболевания.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, связанные с путями врожденного иммунитета и механизмами вирулентности.
- Практическая ценность: предоставляет масштабируемую систему для функциональной валидации мишеней с использованием моделей инфекционного заражения микробами.
- Прогностическая ценность: способствует отбору приоритетных направлений в портфеле разработок за счет получения количественных данных об инфекции и выживаемости для оценки ведущих соединений.
Скрининг и разработка методов анализа
- Готовность анализа: Обеспечивает стандартизированные процедуры подготовки и инъекции личинок для единообразного воздействия исследуемых веществ.
- Количественные показатели: Позволяет измерять показатели выживаемости и бактериальную нагрузку в качестве зависимых переменных в ходе скрининговых кампаний.
- Воспроизводимость: Снижает техническую вариабельность за счет контролируемой механики инъекций и условий окружающей среды.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Моделирует релевантные для человека ответы врожденного иммунитета на бактериальные патогены, такие как Photorhabdus asymbiotica и Escherichia coli.
- Трансляционная преемственность: Способствует переходу от валидации мишени к доклиническим испытаниям эффективности на уровне целого организма.
- Механистическое снижение рисков: Позволяет выяснить пути защиты хозяина и вклад факторов вирулентности перед проведением исследований на млекопитающих.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Метод инъекций личинок является частью этапа ранних открытий, поддерживая валидацию мишеней на основе гипотез и обеспечивая воспроизводимые форматы анализа для скрининга соединений перед оптимизацией ведущих структур.
- Биология открытий: Облегчает функциональную валидацию иммунорелевантных мишеней посредством контролируемого заражения личинок патогенами.
- Скрининг: Позволяет получать данные о зависимости «доза-эффект» и выживаемости, подходящие для высокопроизводительного скрининга иммуномодулирующих или антимикробных агентов.
- Аналитика: Обеспечивает количественные показатели выживаемости (например, показатели выживаемости через 24 часа), позволяющие проводить сравнение различных экспериментальных условий и вариантов лечения.
- Трансляционные исследования: Создает релевантную модели заболевания систему для оценки терапевтического воздействия на исходы инфекции перед переходом к моделям на грызунах.
- Корпоративное повторное использование: Представляет собой стандартизированную недорогую платформу, применимую в нескольких проектах по исследованию иммунологии и инфекционных заболеваний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неоднозначности взаимодействий между хозяином и патогеном.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость и стандартизацию между лабораториями благодаря определенным параметрам инъекций и контролю условий окружающей среды.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет получения ранних сигналов об эффективности и токсичности на модели целого животного.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию кандидатов с учетом рисков на основе данных о выживаемости и элиминации инфекции.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт работы с личинками, проведение анестезии и владение методами микроинъекций.
- Необходимо наличие вытягивателей микропипеток, нанолитровых инжекторов и инструментов для подготовки стеклянных капилляров.
- Для получения воспроизводимых результатов требуется стандартизированное приготовление раствора Рингера и инкубация в условиях окружающей среды при 25°C.
- При тестировании различных микробных штаммов или веществ с разной вязкостью может потребоваться адаптация методики.
- Ограничено размером личинок и допустимым объемом инъекции, что может затруднить введение крупных молекул или твердых частиц.
