Биологический препарат и механическая методика определения вязкоупругих свойств зональных волокон
16 декабря 2021 г.
Протокол описывает метод исследования вязкоупругости внеклеточного матрикса и его зависимости от белкового состава или факторов внешней среды. Целевой матричной системой является зонул мыши. Эффективность метода демонстрируется путем сравнения вязкоупругогого поведения зональных волокон дикого типа с теми, в которых отсутствует микрофибрил-ассоциированный гликопротеин-1.
Важность нашего метода заключается в его способности ответить на вопрос, каковы вязкоупругие свойства зональных волокон, волокон, которые подвешивают хрусталик внутри глаза? Основным преимуществом нашей методики является то, что она может количественно определять вязкоупругие свойства мелких и тонких зонулярных волокон мышей с целевыми генными модификациями и без них. Мутации в генах, кодирующих белки микрофибрилл, лежат в основе нескольких унаследованных синдромных состояний.
Используя нашу технику, мы можем исследовать, как специфические мутации изменяют биомеханические свойства микрофибрилл. Для начала после эвтаназии мыши удалите глаза с помощью мелких щипцов. Вставьте кончик фиксирующей иглы через стенку глаза и расположите его в центре стекловидного тела, заботясь о том, чтобы не повредить хрусталик.
Осторожно переложите пронзенный глаз в трубку, заполненную 4% параформальдегидом и фосфатно-буферным физиологическим раствором. Откройте клапан, соединяющий иглу с фиксированным резервуаром, расположенным на 25 сантиметров выше образца, который поддерживает положительное давление, эквивалентное 15-20 миллиметрам ртутного столба в глазу в течение периода фиксации, и оставьте образец для фиксации на ночь. На следующий день снимите фиксирующую иглу и промойте глаз в течение 10 минут в фосфатно-буферном физиологическом растворе.
Используя офтальмологические хирургические ножницы и стереомикроскоп, сделайте разрез полной толщины в стенке глаза возле головки зрительного нерва. Вытяните разрез вперед к экватору, а затем вокруг экваториальной окружности глаза, тщательно щадя тонкие цилиарные отростки и связанные с ними зональные волокна. Обнажите заднюю поверхность хрусталика, удалив заднюю часть земного шара.
Удалите рассеченный глаз из буферного раствора с помощью щипцов и поместите его на сухую салфетку с роговицей, обращенной вниз. Осторожно перетащите роговицу по поверхности салфетки, чтобы высушить ее. Нанесите каплю мгновенного клея на дно 50-миллиметровой чашки Петри и закрепите к ней платформу.
Поместите блюдо на сценическую пластину стереомикроскопа так, чтобы колодец с клеем был в поле зрения. Чтобы поместить глаз в платформенные колодцы чашки Петри, добавьте три микролитра быстрорастворимого клея. Осторожно поместите его в колодец и быстро отрегулируйте так, чтобы задняя часть линзы была обращена вверх.
Высушите открытую сторону хрусталика, аккуратно промокнув уголком сухой салфетки. Для измерения зонального вязкоупругого отклика включите весы, поместите чашку Петри на весы, затем запустите программу регистрации масштаба и программное обеспечение камеры. Включите контроллер серводвигателя.
Запустите приложение контроллера на компьютере и установите параметры движения с шагом 50 микрометров. Создайте изгиб на 90 градусов в капиллярном стержне. Вставьте изогнутый капилляр в держатель капиллярного зонда и затяните крепежные винты.
К кончику капилляра добавьте небольшую бусину УФ-отверждающего клея. Переместите наконечник капиллярного зонда с помощью ручной регулировки манипулятора и поместите его непосредственно над верхней частью объектива. С помощью переднего визуального осмотра и бокового обзора с помощью камеры микроскопа проверьте, что нижняя часть ультрафиолетового клея кажется центрированной над верхней частью объектива.
Глядя через камеру, опустите наконечник зонда до тех пор, пока ультрафиолетовый клей не вступит в контакт с объективом и не покроет от 1/3 до 1/2 его верхней поверхности. Отвержьте клей, используя направленный почти видимый источник ультрафиолетового света длиной от 380 до 400 нанометров и интенсивностью около одного милливатта. Добавьте раствор PBS в чашку Петри до тех пор, пока глаз не будет покрыт на глубину не менее двух миллиметров.
Поместите цилиндрическую линзу перед микроскопом и вплотную к чашке Петри, не прикасаясь к ней. При этом запустите ведение журнала в программе таймера. Сфотографируйте глаз и зонд с помощью камеры.
Через 60 секунд начните смещение на 50 микрометров. Повторяйте каждые 60 секунд до тех пор, пока эксперимент не будет завершен, как показывает разрыв всех зональных волокон. Сохраните данные журналирования масштабирования после завершения выполнения и экспортируйте их в совместимый формат электронной таблицы.
Кроме того, сохраните снимки объектива, полученные во время бега. Импортируйте данные в электронную таблицу. Используя первое и последнее показания шкалы, интерполируйте дрейф фонового чтения с течением времени из-за испарения, а затем вычтите интерполированный фон из показаний в каждой точке времени.
После выполнения анализа и корректировки на испарение график вязкоупругих данных инвертируется. Величина мгновенных и расслабленных сил увеличивается с каждым шагом примерно до 1000 секунд, а затем падает, когда зонулярные волокна начинают разрываться, пока не будет достигнута 1 500 секундная точка времени, когда все волокна сломаны. Для этой демонстрации также сравнивали вязкоупругую реакцию для мышей дикого типа и с дефицитом MAGP-1.
В начальное время от нуля до 600 секунд графики похожи друг на друга, предполагая, что вязкоупругие свойства зональных волокон существенно не изменились. Однако у нокаутирующей мыши MAGP-1 волокна разрываются преждевременно. Зонулярные силы разрушения волокон были получены методом подтягивания для MAGP-1 по сравнению с мышами дикого типа на стадиях одного месяца и года.
Результаты показали, что прочность волокон увеличивается с возрастом у мышей дикого типа. Любой случайный контакт с чашкой Петри во время этих шагов может привести к смещению глазной стенки относительно глазной линзы, потенциально повреждая зонулярные волокна. Этот анализ подтягивания помогает идентифицировать белки, которые способствуют прочности на растяжение микрофибрилл.
Мы будем использовать эту информацию для построения более реалистичных моделей интерьера из зональных волокон.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается метод изучения вязкоупругих свойств внеклеточного матрикса, в частности, цинновых зонул мыши. В работе показано, как белковый состав и факторы окружающей среды влияют на эти свойства, что продемонстрировано путем сравнения зонулярных волокон дикого типа и волокон с дефицитом микрофибриллярного ассоциированного гликопротеина-1.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология
- Биомеханика
Теоретическая часть
- Зонарные волокна удерживают хрусталик в глазу.
- Вязкоупругие свойства имеют решающее значение для понимания биомеханического поведения.
- Мутации в белках микрофибрилл могут приводить к наследственным синдромальным состояниям.
- Понимание этих свойств может помочь в исследовании генетического влияния на здоровье глаз.
Цель исследования
- Количественно определить вязкоупругие свойства цингулярных волокон.
- Оценить влияние специфических генных мутаций на эти свойства.
- Предложить надежный метод исследования хрупких биологических структур.
Используемые методы
- Эвтаназия мышей для получения цингулярных волокон.
- Использование тонкого пинцета для удаления глазного яблока.
- Введение фиксирующей иглы в глаз для проведения анализа.
- Сравнение волокон мышей дикого типа и генетически модифицированных мышей.
Основные результаты
- Метод позволяет успешно количественно определить вязкоупругие свойства.
- Различия в свойствах наблюдались между волокнами дикого типа и мутантными волокнами.
- Было показано, что специфические мутации изменяют биомеханические характеристики.
- Данный метод применим для дальнейших генетических исследований.
Выводы
- Данный метод позволяет получить представление о биомеханических свойствах цинновых связок.
- Он может быть использован для изучения эффектов генетических модификаций.
- Полученные результаты могут способствовать пониманию синдромальных состояний, связанных с патологиями глаз.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод позволяет количественно оценить вязкоупругие свойства волокон цинового связочного аппарата, представляющих собой модельную систему внеклеточного матрикса, чтобы определить, как специфические мутации белков изменяют биомеханическую функцию. Обеспечивая чувствительный и воспроизводимый анализ целостности волокон при контролируемом механическом напряжении, этот подход способствует валидации мишеней в механизмах глазных заболеваний и снижению рисков при доклинических испытаниях генетической терапии. Данный метод представляет собой масштабируемую платформу для изучения взаимосвязей между белками внеклеточного матрикса, которые имеют значение при заболеваниях соединительной ткани не только в глазу.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы, связывая белковый состав зонул с измеримыми изменениями в вязкоупругом поведении.
- Операционная ценность: Обеспечивает функциональную валидацию мишеней посредством прямого сравнения волокон дикого типа и генетически модифицированных волокон при стандартизированной механической нагрузке.
- Прогностическая ценность: Помогает в приоритизации портфеля исследований за счет выявления белков, потеря которых коррелирует с преждевременным разрушением волокон при определенных порогах смещения.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: позволяет получать валидированные биологические системы (препараты цинокулярных волокон) с количественно определяемыми показателями натяжения, подходящими для последующего скрининга соединений или генетического анализа.
- Воспроизводимость: стандартизированные протоколы фиксации, монтажа и смещения обеспечивают согласованность базовых измерений в различных экспериментальных сериях.
- Масштабируемость: конструкция платформы позволяет осуществлять параллельную обработку нескольких образцов с использованием идентичных лунок чашек Петри и конфигураций капиллярных зондов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Моделирует синдромальные состояния человека, вызванные мутациями белков микрофибрилл, что позволяет проводить доклиническую оценку взаимосвязей между генотипом и фенотипом.
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает переход от этапа валидации мишени к доклинической оценке, предоставляя единый биомеханический показатель для систем дикого типа и моделей заболеваний.
- Снижение механистических рисков: Позволяет определить, обусловлены ли наблюдаемые фенотипические изменения нарушением вязкоупругости внеклеточного матрикса, а не побочными эффектами в процессе развития.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод встраивается в континуум от поиска до доклинических исследований, предоставляя биомеханические данные на ранних этапах, что позволяет оценить достоверность мишени и готовность анализа для последующей валидации.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез путем количественной оценки влияния генных мутаций на несущую способность зонулярных микрофибрилл.
- Скрининг: позволяет создавать препараты, готовые к анализу, с данными о зависимости силы от смещения, что дает возможность сравнивать условия дикого типа, гетерозиготных и гомозиготных мутантных форм.
- Аналитика: предоставляет измерения натяжения с временным разрешением, позволяющие рассчитать параметры мгновенной и релаксированной силы, что облегчает статистическое сравнение различных генотипов.
- Трансляционные исследования: предоставляет релевантную для заболевания систему для оценки того, восстанавливает ли экспрессия спасающего белка вязкоупругие профили до базовых показателей дикого типа.
- Применение в организациях: создает стандартизированную биомеханическую платформу, применимую к другим растяжимым системам внеклеточного матрикса (например, сухожилиям, связкам) с минимальной адаптацией протокола.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность за счет изоляции вклада конкретных белков ВКМ в вязкоупругость на уровне ткани.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизированные, недорогие измерения с чувствительностью, достаточной для обнаружения возрастных и генотип-зависимых изменений прочности волокон.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go»), предоставляя объективные биомеханические критерии для приоритизации целей в программах, направленных на соединительную ткань.
- Влияние на портфель: Обеспечивает продвижение проектов с учетом рисков путем количественной оценки функциональных последствий генетических модификаций для несущих сетей ВКМ.
Особенности реализации
- Требуются навыки в области диссекции глаза, микрохирургии и биомеханического тестирования под микроскопом.
- Метод опирается на использование прецизионного оборудования, включая контроллеры сервоприводов, весы с датчиками силы и системы УФ-отверждения для крепления зонда к линзе.
- Необходимы стандартизированные процедуры фиксации и монтажа для предотвращения смещения образца или появления механических артефактов при измерении натяжения.
- При применении метода вытягивания (pull-up technique) к системам внеклеточного матрикса с иной структурной организацией или пределом прочности на разрыв следует учитывать необходимость адаптации протокола.
- Практические ограничения включают время подготовки образцов и необходимость контроля условий окружающей среды (например, использование PBS-буфера) для минимизации артефактов испарения при длительных измерениях.
