Высокопроизводительная конфокальная визуализация квантовых точек-конъюгированных пиковых тримеров SARS-CoV-2 для отслеживания связывания и эндоцитоза в клетках HEK293T
21 апреля 2022 г.
В этом протоколе квантовые точки, конъюгированные с рекомбинантным всплеском SARS-CoV-2, позволяют клеточным анализам контролировать связывание шипов с hACE2 на плазматической мембране и последующий эндоцитоз связанных белков в цитоплазму.
Мы создали технологию платформы для SARS COVID 2, которая может быть применима к другим вирусам с опосредованным Spike распознаванием клеток и проникновением в качестве первого шага в клеточной вирусной инфекции. Квантовые точки яркие, стабильные, и их поверхность может быть функционализирована для различных клеточных применений. Используя этот метод, мы можем визуализировать и измерить интернализацию Спайка в клетках.
Приготовить 0,1% BSA. Добавьте 130 микролитров 7,5% BSA к 10 миллилитрам носителей изображений в смеси. Для последовательного разбавления от 6,1 до трех и трех частей добавьте 14,26 микролитров QD Spike к 285,74 микролитрам 0,1% BSA, чтобы получить самую высокую концентрацию 20 наномолей.
Затем добавьте 100 микролитров 20 наномолей или QD Spike к 200 микролитрам 0,1% BSA, чтобы сделать второй бред 6,67 наномолей QD Spike. Удалите все отработанные среды из каждой скважины с помощью многоканального аспиратора, промыть один раз многоканальной пипеткой со 100 микролитрами среды визуализации на лунку, затем аспирировать 100 микролитров носителя изображения. Добавьте обратно 50 микролитров раствора QD Spike на лунку и инкубируйте пластину в течение трех часов в увлажненном инкубаторе при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом.
Надев защитное снаряжение, подготовьте среду визуализации 4% PFA и 0,1% PSA внутри стерильного шкафа биобезопасности, аспирируйте 50 микролитров QD Spike из каждой скважины и добавьте 100 микролитров 4% PFA на скважину с помощью автоматизированной многоканальной пипетки, чтобы избежать сушки скважин. Инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре, затем трижды промыть PBS, приготовить темно-красный ядерный краситель, разбавив пятимиллиметровый раствор при одном до 1000 в PBS, аспирировать PBS и добавить обратно 50 микролитров разбавленного ядерного красителя на лунку. Инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре, затем трижды промывайте PBS, визуализируйте пластину или запечатывайте ее с помощью герметика пластин для последующего получения изображения.
Храните пластину при четырех градусах Цельсия. Запустите программное обеспечение для платформы обработки изображений. После регистрации в платформе визуализации создайте новый протокол сбора, выбрав тип пластины в качестве 96-настенной прозрачной нижней пластины изображения, выберите оптический режим, который стал фокусным, а увеличение в 40 раз - погружением в воду, выберите биннинг как один.
Выберите режим для цифровых контрастов лиц, таких как высокая контрастность, чтобы создать четко определенные тела клеток. Сделайте снимок, чтобы убедиться, что этот заголовок подходит, как показано в окне изображения, выберите подходящий канал C для использования с линией ячейки ACE2-GFP, чтобы визуализировать трафик ACE2 внутри ячейки. Чтобы создать пользовательский канал QD, выберите выпадающее меню треугольника и выберите возбуждение в диапазоне излучения 405 нанометров в диапазоне 608 нанометров, выберите скважину с надежным цитоплазматическим сигналом QD, чтобы установить время экспозиции, мощность лазера и положение высоты Z.
Проверьте, создает ли высота по умолчанию изображение ячеек в нужной фокальной плоскости. Положение Z будет ниже для эндоцитозной пункты, чем положение Z для плазматической мембраны. Выберите время экспозиции, обычно от 100 до 300 миллисекунд, которое создает яркое изображение с уровнями серого, по крайней мере, в три раза превышающими фоновый сигнал.
При 20 наномоле уровни серого должны составлять примерно 6 000 атомных единиц с временем экспозиции 200 миллисекунд и мощностью лазера 80%. Проверьте уровни серого, щелкнув правой кнопкой мыши на изображении, полученном с функцией снимка в каждом канале и выбрав интенсивность шоу, затем щелкните левой кнопкой мыши на интересующем объекте или фоне, чтобы просмотреть уровень серого для этого пикселя, отрегулируйте мощность лазера для точной настройки интенсивности интересующих объектов. Сохраните протокол сбора, переключитесь на запуск эксперимента и введите имя пластины, запустите эксперимент.
Транслокация как QD, так и ACE2 была визуализирована с использованием флуоресцентной микроскопии и ACE2-GFP экспрессирующей клеточной линии. Сегментация изображения и последующий анализ выполнялись для извлечения соответствующих параметров, таких как количество пятен. Во-первых, ядра были сегментированы из канала ядерного маркера для создания популяции ROI.
Затем область ROI, очерчивающая ячейку с сегментированием с использованием канала ACE2-GFP. Наконец, точки всплеска QD 608 были сегментированы из области ROI клеток, интернализованные сигналы QD и ACE2 показали сильную колокализацию. Эксперимент по концентрационному ответу с шестью различными концентрациями QD Spike проводился в клетках HEK 293T.
При определении оптических концентраций QD, QDS можно использовать до 2,22 наномолей, однако рекомендуется использовать концентрации 10 наномолей или выше для обеспечения надежного отклика. Во время конъюгации с QD может произойти агрегация белка. Агрегаты были обнаружены в растворе QD в виде ярких слипшихся осадков и клеток HEK 293T, QD инкубировали с нейтрализованными антителами, начиная с 30 микрограммов на микролитр перед добавлением к клеткам, эти антитела блокировали интернализацию связывания и вызывали снижение количества пятен по сравнению с клетками, обработанными только QD.
Это эссе также может быть использовано для высокопроизводительного скрининга, проведения оценки нейтрализующих антител для выявления каламбурных противовирусных препаратов к блоку вирусного проникновения и адаптировано для изучения вновь возникающих вариантов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлена платформа, использующая квантовые точки, конъюгированные с S-белками SARS-CoV-2, для визуализации и количественной оценки связывания S-белка с рецептором hACE2 на клеточных мембранах, а также последующего эндоцитоза этих белков в цитоплазму. Данный метод позволяет изучить начальные этапы клеточного вирусного заражения и обладает широкой применимостью к другим вирусам, проникновение которых осуществляется при участии S-белков.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Клеточная биология
- Молекулярная биология
- Вирусный патогенез
Теоретические основы
- SARS-CoV-2 взаимодействует с hACE2 для проникновения в клетку, что является критическим этапом вирусной инфекции.
- Квантовые точки обеспечивают стабильный и эффективный способ отслеживания биологических процессов.
- Понимание механизмов интернализации спайкового белка может способствовать разработке противовирусных препаратов.
Используемые методы
- Флуоресцентная микроскопия для визуализации клеточных процессов.
- Клетки HEK 293T в качестве биологической модели для экспериментов.
- Эксперименты по зависимости от концентрации для оптимизации использования квантовых точек.
Основные результаты
- Успешная визуализация интернализации спайкового белка и его колокализации с ACE2.
- Определение оптимальных концентраций квантовых точек для получения надежных результатов.
- Демонстрация возможности оценки влияния нейтрализующих антител на проникновение вируса.
Выводы
- В данном исследовании представлена новая методика отслеживания механизмов проникновения вирусов в клетку.
- Этот подход потенциально может привести к прогрессу в скрининге противовирусных препаратов и разработке терапевтических средств.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод обеспечивает высокопроизводительную визуализацию связывания и эндоцитоза вирусного спайк-белка, что способствует валидации мишеней для противовирусных препаратов на ранних этапах. Количественная оценка взаимодействий рецептор-лиганд и их трафика в физиологически релевантном клеточном контексте позволяет снизить механистические риски при разработке ингибиторов проникновения вируса. Платформа поддерживает масштабируемый скрининг нейтрализующих антител и ведущих соединений-кандидатов против SARS-CoV-2 и других вирусов, проникновение которых опосредовано спайк-белком.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет напрямую наблюдать связывание спайк-белка с hACE2 и его последующую интернализацию, что подтверждает механизм проникновения вируса в качестве терапевтической мишени.
- Практическая ценность: использование конъюгатов квантовых точек в качестве стабильных флуоресцентных зондов позволяет отслеживать динамику спайк-белка с высоким отношением сигнал/шум, что снижает количество ложноотрицательных результатов в анализах на связывание.
- Прогностическая ценность: данные зависимости «концентрация-ответ» (например, эффективная сигнализация при ≥10 nanomole QD Spike) обосновывают дозозависимое моделирование взаимодействия с мишенью для оптимизации ведущих соединений.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Сегментация ядер, клеток, экспрессирующих ACE2-GFP, и точек QD Spike позволяет проводить количественный анализ количества точек для высокопроизводительного скрининга ингибиторов связывания и интернализации.
- Практическая ценность: Протокол включает автоматизированные этапы фиксации, окрашивания ядер и получения изображений, совместимые с форматом 96-луночных планшетов, что способствует стандартизации и воспроизводимости анализа.
- Масштабируемость: Продемонстрированное использование в экспериментах по зависимости «доза-эффект» с шестью концентрациями и разведениями в трех повторах указывает на готовность к кампаниям по скринингу средней и высокой пропускной способности.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная ценность: Колокализация интернализованного QD Spike с ACE2-GFP обеспечивает механистический показатель для оценки нейтрализующих антител, блокирующих проникновение вируса, что напрямую способствует оценке ведущих соединений.
- Доклиническая преемственность: Возможность тестирования эффективности антител (например, снижение количества пятен при использовании нейтрализующих антител в концентрации 30 μg/μL) поддерживает принятие решений о продвижении разработки противовирусных препаратов с учетом рисков.
- Адаптивность: Платформа может быть применена к новым вариантам и другим вирусам, проникновение которых опосредовано спайк-белком, что повышает долгосрочную полезность программ по подготовке к пандемиям.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в непрерывный процесс разработки противовирусных средств — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинической оценки, что позволяет проводить итеративную проверку соединений, нацеленных на спайковый белок.
- Открывающая биология: Позволяет проверить гипотезы о взаимодействии spike-hACE2 и путях эндоцитоза, уточняя механизм действия ингибиторов проникновения.
- Скрининг: Обеспечивает количественные результаты визуализации (подсчет пятен, колокализация), что позволяет достоверно сравнивать эффекты соединений на связывание и интернализацию вируса.
- Аналитика: Позволяет извлекать показатели количества и интенсивности пятен из сегментированных каналов, предоставляя статистические данные для анализа зависимости «доза-эффект» и профилирования ингибирования.
- Трансляционные исследования: Связывает данные о связывании и интернализации с функциональными результатами (например, снижением проникновения spike под действием антител), что помогает в принятии решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go decisions).
- Корпоративное повторное использование: Протокол разработан для применения с различными мишенями и клеточными линиями; метод конъюгации с квантовыми точками может быть адаптирован для других лигандов или рецепторов.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: обеспечивает прямую визуализацию механизмов проникновения вируса, уменьшая неопределенность механизмов при валидации мишени.
- Операционная ценность: стабильность и яркость квантовых точек обеспечивают согласованное детектирование сигнала в разных сериях экспериментов, что повышает воспроизводимость анализа.
- Стратегическая ценность: позволяет на ранних этапах выявлять эффективные ингибиторы проникновения, снижая риск неудач на поздних стадиях из-за отсутствия взаимодействия с мишенью.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации перспективных соединений на основе количественных данных об ингибировании интернализации, что повышает эффективность использования капитала в программах разработки противовирусных препаратов.
Особенности реализации
- Требуются навыки в области флуоресцентной микроскопии, работы с квантовыми точками и анализа сегментации изображений.
- Метод зависит от наличия систем конфокальной или широкопольной флуоресцентной визуализации с настраиваемыми фильтрами возбуждения/эмиссии (например, возбуждение 405 nm, эмиссия 608 nm для QD608).
- Необходима стандартизация между группами исследователей в отношении разведения антител, времени инкубации и этапов промывки для минимизации вариабельности при подсчете количества точек.
- Необходимо учитывать агрегацию квантовых точек в процессе конъюгации, что требует осветления раствора (например, путем центрифугирования или фильтрации) перед использованием.
- Адаптация для систем, отличных от HEK293T, может потребовать оптимизации экспрессии ACE2 или использования альтернативного мечения рецепторов для исследований колокализации.
