Анализы ACT1-CUP1 определяют субстрат-специфическую чувствительность сплайсеосомальных мутантов в почковых дрожжах
30 июня 2022 г.
Анализ ACT1-CUP1, анализ роста меди, обеспечивает быстрое считывание сплайсинга РНК-предшественника (пре-мРНК) и влияние мутантных факторов сплайсинга на сплайсеосомную функцию. Это исследование предоставляет протокол и подчеркивает возможность настройки для решения интересующего вопроса сплайсинга.
Анализ ACT1-CUP1 может определить, влияет ли мутация на сплайсинг РНК до мессенджера, и дать представление о том, какой этап сплайсинга наиболее подвержен влиянию. Анализ ACT1-CUP1 связывает мутацию фактора сплайсинга с его влиянием на сложный процесс сплайсинга. Он использует простое считывание фенотипа роста и имеет широкий диапазон чувствительности.
Эффективное использование времени важно при проведении анализа ACT1-CUP1. Начните с анализа от пяти до 10 штаммов, чтобы свести к минимуму вызванные стрессом аберрации роста. Демонстрировать этот процесс будут я и Изабель Марасиган, исследователь из моей лаборатории.
Для начала добавьте 790 миллиграммов агара и перемешивание в каждую бутылку. В большом стакане подготовьте среду для роста выпадения лейцина для всех медных пластин, которые будут залиты. Это включает в себя 265 миллиграммов азотистой основы дрожжей, 64 миллиграмма капельной смеси, минус лейцин и 34 миллилитра деионизированной воды на каждую наливаемую тарелку.
Затем добавьте 34 миллилитра раствора выпадающей среды лейцина в каждый подготовленный 100-миллилитровый флакон и крышку алюминиевой фольгой. Далее автоклав стерилизуют и растворяют агар, используя рекомендуемый для автоклава жидкостный цикл. Как можно быстрее после автоклавирования добавляйте в каждый флакон по четыре миллилитра 20% глюкозы.
Затем сопоставьте этикетку тюбика с этикеткой бутылки, чтобы добавить два миллилитра разведения сульфата меди каждый в его предполагаемую бутылку. Используя перемешиваемую пластину, перемешайте в течение примерно 30 секунд и налейте или пипетку 35 миллилитров в маркированную пластину, избегая пузырьков. На штамм дрожжей добавьте девять миллилитров среды роста лейкина и один миллилитр 20% глюкозы в стерильную коническую трубку с 50 миллилитрами.
Используя стерильную палочку или наконечник пипетки, соберите небольшой образец дрожжей и привите среду. Затем встряхните все ночные культуры при 180 оборотах в минуту и 30 градусах Цельсия. Затем добавьте 100 микролитров культуры в кювету, содержащую 900 микролитров воды на штамм.
После этого измерьте оптическую плотность с помощью спектрофотометра и рассчитайте разбавление, необходимое для оптической плотности 0,5 в конечном объеме в два миллилитра. Затем разбавьте каждый штамм до оптической плотности 0,5 в 10% глицерине и повторно измерьте оптическую плотность, чтобы подтвердить, что плотность клеток находится в желаемом диапазоне. После установки стерильного рабочего места зажгите горелку Бунзена.
Для 48-контактного репликатора пипетку 200 микролитров каждого разбавленного штамма в отдельный колодец из 96-луночной пластины и заполните пустые пространства в сетке шесть на восемь 200 микролитрами 10% глицерина. Затем окуните репликатор в неглубокую посуду с 95% этанолом и пламени для стерилизации. Дайте ему остыть в течение как минимум двух минут после того, как пламя погаснет, чтобы избежать теплового удара по клеткам.
Поместите четыре пластины рядом с горелкой и снимите крышки. Опустите репликатор в пластину с 96 лунками и поднимите ее одним быстрым движением. Затем аккуратно положите на тарелку и слегка покачивайтесь взад и вперед, чтобы облегчить хорошую передачу.
Поднимите вверх одним быстрым движением и поместите в точно такую же ориентацию в 96-луночную плиту. После того, как пластина была покрыта, двигайтесь плавным движением в сторону, но все еще внутри стерилизующего зонтика пламени. Дайте пластинам полностью высохнуть, прежде чем надеть крышки, обычно три-пять минут.
Затем высиживают пластины в течение трех дней при 30 градусах Цельсия. После снятия пластин с инкубатора визуально осмотрите их. Анализ роста показал, что по мере увеличения концентрации меди штаммы с более низким сращиванием показывают снижение слияния до такой степени, что концентрация меди становится смертельной.
Дрожжевой фон включает в себя нарушенный ген ADE2, в результате чего колонии имеют различные оттенки красного. А зрелые колонии были темно-красного цвета. Во время обшивки, если репликатор поднят вверх при движении влево или вправо, привести под углом или встряхнуть над пластиной, можно создать колонии овальной формы, или микроколонии из мелких капель клеточного раствора.
Дрожжи с репортером A3c сохранились до 0,15 миллимолярной меди, в то время как репортерные клетки дикого типа сохраняли жизнеспособность до конца диапазона протестированных концентраций меди. Результаты анализа показали, что различные основания в позиции 57 snRNA U6 оказывают уникальное воздействие на сплайсеосому в сочетании с мутацией 5 простых или ветвистых участков. В то время как U57c является аддитивной мутацией, снижающей толерантность к меди, в сочетании с A3c и филиалом сайта G репортеров.
Напротив, U57a увеличивает толерантность к меди, поскольку способствует переходу ко второму этапу. После того, как возмущение сплайсинга идентифицировано с помощью ACT1-CUP1, исследования могут перейти к более количественным методам, таким как расширение праймера и идентификация нарушенного молекулярного взаимодействия с помощью EMSA и ферментативного зондирования. ACT1-CUP1 был основополагающим анализом, формирующим наше понимание надежности и селективности дрожжевой сплайсеосомы.
И это продолжает расширять наше понимание сплайсеосомальной функции.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Анализ ACT1-CUP1 представляет собой тест роста на медном носителе, который позволяет оценить сплайсинг пре-мРНК и влияние мутантных факторов сплайсинга на функцию сплайсосомы. В данной работе приводится протокол проведения этого анализа и подчеркивается возможность его адаптации для различных исследований сплайсинга.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Генетика
- Молекулярная биология
Теоретические основы
- Анализ ACT1-CUP1 позволяет выявлять мутации, влияющие на сплайсинг пре-мРНК.
- Он дает представление о том, какие этапы сплайсинга наиболее подвержены влиянию мутаций.
- Данный анализ связывает мутации факторов сплайсинга с их воздействием на процессы сплайсинга.
- В анализе используется считывание фенотипа роста, что делает его эффективным и простым в исполнении.
Цель исследования
- Предоставить подробный протокол проведения анализа ACT1-CUP1.
- Продемонстрировать возможность адаптации данного анализа для решения конкретных вопросов, касающихся сплайсинга.
- Подчеркнуть важность минимизации вызванных стрессом отклонений в росте при планировании эксперимента.
Используемые методы
- Использование анализа ACT1-CUP1 для оценки мутаций факторов сплайсинга.
- Тестирование от пяти до десяти штаммов для снижения вариабельности результатов.
- Сотрудничество со студентами-исследователями в демонстрационных целях.
- Наблюдение за фенотипами роста как показатель эффективности сплайсинга.
Основные результаты
- Данный анализ эффективно выявляет мутации, нарушающие сплайсинг пре-мРНК.
- Результаты указывают на конкретные этапы сплайсинга, на которые влияют мутации.
- Продемонстрирована адаптивность анализа для решения различных исследовательских задач.
- Предложен надежный метод оценки влияния факторов сплайсинга.
Выводы
- Анализ ACT1-CUP1 является ценным инструментом для изучения механизмов сплайсинга.
- Адаптация анализа позволяет проводить целевые исследовательские запросы.
- Эффективное планирование эксперимента имеет решающее значение для получения точных результатов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Анализ ACT1-CUP1 обеспечивает фенотипический считываемый сигнал функции сплайсомы, позволяя на ранних этапах исследовать терапевтические мишени в путях процессинга РНК. Связывая генетические пертурбации с измеряемыми результатами роста, этот метод способствует механистическому снижению рисков при проверке гипотез, направленных на сплайсому, в рамках биологических исследований. Данный анализ обеспечивает прогностическую уверенность в валидации мишеней путем количественного определения субстрат-специфической чувствительности, что позволяет оптимизировать портфель препаратов для модуляции РНК.
Стратегические приложения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверить терапевтические гипотезы путем корреляции мутаций сплайсосомы с фенотипической чувствительностью к меди, что проясняет функциональное влияние на сплайсинг пре-мРНК.
- Практическая ценность: Обеспечивает снижение биологических рисков за счет прямого считывания эффектов мутаций на эффективность сплайсинга, что способствует оценке достоверности выбора мишени.
- Прогностическая ценность: Повышает прогностическую достоверность путем выявления синергических или антитетических взаимодействий между компонентами сплайсосомы, что служит основой для стратегий поиска ведущих соединений.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующих рабочих процессов путем установления базовых фенотипов сплайсинга в различных мутантных штаммах.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации и воспроизводимости анализа с помощью количественных измерений роста при заданных концентрациях меди.
- Полезность платформы: Повышение готовности и масштабируемости скрининга за счет использования воспроизводимых штаммов дрожжей и определенных репортерных систем.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: связывает данные о механизмах, полученные на этапе поиска, с доклинической валидацией путем определения значимых для заболевания нарушений сплайсинга.
- Согласование биомаркеров: позволяет идентифицировать фенотипические пороги, зависящие от сплайсинга, которые могут лечь в основу разработки трансляционных биомаркеров.
- Продвижение с учетом рисков: поддерживает принятие решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) путем количественной оценки влияния мутаций факторов сплайсинга на точность сплайсинга специфических субстратов.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Анализ ACT1-CUP1 применяется на различных этапах процесса разработки, поддерживая проверку гипотез на стадии раннего поиска (Early Discovery), обеспечивая готовность анализа для скрининга (Screening) и предоставляя данные для снижения механистических рисков перед этапами идентификации ведущего соединения (Lead Identification) и доклинической оценки.
- Открытия в биологии: способствует проверке гипотез и уточнению путей передачи сигналов путем установления связи между мутациями сплайсосомы и фенотипическими результатами с помощью анализов роста, чувствительных к меди.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет использования стандартизированных штаммов дрожжей, определенных репортерных конструктов и количественных показателей роста в градиентах концентрации меди.
- Аналитика: позволяет получить измеримые зависимые переменные (конфлюэнтность роста, пороги выживаемости), что дает возможность сравнивать эффективность сплайсинга при различных генетических фонах.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническими исследованиями путем установления релевантных для заболевания фенотипов сплайсинга, которые моделируют специфическую уязвимость субстрата.
- Корпоративное повторное использование: служит многократно используемой платформой для изучения механизмов сплайсинга для различных классов мишеней и панелей мутаций.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую уверенность в валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности функции сплайсосомы посредством фенотипической корреляции.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость благодаря определенным составам сред, посеву с использованием репликатора и объективной оценке роста.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет раннего обнаружения дефектов сплайсинга, что снижает биологические риски на поздних этапах программ, направленных на РНК.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию с учетом рисков путем количественной оценки чувствительности сплайсинга к конкретным субстратам, что помогает определять направления инвестиций в кандидатов, модулирующих сплайсосому.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области генетики дрожжей, молекулярного клонирования и проведения фенотипического анализа.
- Для получения стабильных результатов необходимы соблюдение правил стерильности, доступ к автоклаву, спектрофотометрия и использование репликатора.
- Требуется межкомандная стандартизация процедур работы со штаммами, приготовления растворов меди и протоколов инкубации для обеспечения сопоставимости данных.
- При распространении метода на системы, отличные от дрожжевых, или на альтернативные репортеры необходимо учитывать особенности адаптации, так как специфичность сигнала зависит от механизмов сплайсинга дрожжей.
- Практические ограничения включают продолжительность анализа (более 3 дней), чувствительность к стрессовым факторам окружающей среды и зависимость достоверности результатов от правильного сплайсинга репортеров ACT1-CUP1.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:47
Pouring Plates for the ACT1-CUP1 Assay
2:13
ACT1-CUP1 Plate Preparation
3:26
Plating the Strains on the Copper Plates, Data Collection, and Analysis
5:09
Results: Impact of Mutant Splicing Factors on the Spliceosomal Function
6:50
Conclusion
