Использование красного окрашивания Alizarin для обнаружения химически индуцированной потери костной массы у личинок рыбок данио
28 декабря 2021 г.
Здесь мы использовали красное окрашивание ализарином, чтобы показать, что воздействие ацетата свинца вызывает изменение костной массы у личинок рыбок данио. Этот метод окрашивания может быть адаптирован для исследования потери костной массы у личинок рыбок данио, вызванной другими опасными токсикантами.
Этот метод может помочь обнаружить костную токсичность, вызванную химическими веществами у рыбок данио. Ализарин Красное окрашивание неподвижной ткани генерирует постоянную запись скелетных изменений, которая может облегчить сравнение нескольких образцов. Этот метод может быть полезен для изучения остеопороза в модели рыбок данио, поскольку одной из характеристик остеопороза является уменьшение костной массы.
Удалите 10 личинок рыбок данио случайным образом из каждой группы через девять дней после оплодотворения и зафиксируйте рыбу в одном миллилитре 2% параформного альдегида и 1X PBS в течение двух часов. Деканировать раствор и промыть личинку рыбок данио, используя 100 миллимоляров Tris HCL с рН 7,5 или 10 миллимоляров хлорида магния. Для окрашивания декантируют раствор и инкубируют личинку в течение пяти минут в серии растворов, как описано в рукописи.
После окончательной инкубации декантируют раствор и удаляют пигмент путем отбеливания раствором, состоящим из 3% перекиси водорода и 0,5% гидроксида калия. Наблюдают один раз в 10 минут, пока пигмент не будет полностью удален. Промыть личинку рыбки данио несколько раз 25% глицерином, 0,1% гидроксидом калия в течение 10 минут каждый, пока не останется пузырьков.
Окрашивают в личинку путем замачивания в одном миллилитре 0,01% ализарина. Декантировать раствор и добавить один миллилитр 50%-го глицерина или 0,1%-го гидроксида калия для очистки фона. Хранить рыбу в свежем 50% глицерине или 0,1% гидроксида калия для последующего наблюдения.
Переносите по одной личинке за раз на стеклянную горку, удерживая личинку в середине капли жидкости. Понаблюдайте за личинкой под стереомикроскопом. Включите фотокамеру.
Откройте программное обеспечение и сохраните настройки по умолчанию. Нажмите на AE и выберите подходящее время экспозиции, чтобы получить лучшее изображение. Захват всех изображений с одинаковыми настройками.
Сохраните изображения в формате dot tiff для последующего анализа. Дважды щелкните значок imageJ. Чтобы проанализировать сохраненные изображения, нажмите на файл, затем откройте, затем нажмите на изображение, затем введите и выберите восьми бит.
Нажмите на редактирование и инвертируйте. Нажмите на анализ, затем откалибруйте. Выберите Некалиброванный OD во всплывающем интерфейсе.
Проверьте глобальную калибровку в левом нижнем углу нижнего интерфейса и нажмите кнопку «ОК». Нажмите «Анализировать», установите масштаб, затем удалите масштаб. Проверьте глобальный ниже и нажмите OK.
Нажмите на анализ, затем установите измерения. Выберите область элемента во всплывающем интерфейсе. Установите предел до порогового значения ниже, чтобы измерить только выбранный диапазон, и нажмите кнопку «ОК».
Нажмите на изображение, отрегулируйте, затем порог и сдвиньте ползунок в середине всплывающего интерфейса. Чтобы выбрать соответствующее пороговое значение, чтобы были выбраны все цели, которые будут тестироваться в одном изображении. И нажмите кнопку Установить.
Нажмите на анализ, затем измерьте, сохраните даты. Alizarin Red Staining - это чувствительный и специфический метод измерения изменений минерализации костей у личинок рыбок данио. Через девять дней после оплодотворения многие кости скелета головы, такие как парасфеноидные, оперкулярные, цератобранхиальные и нотохорды, минерализуются и, следовательно, окрашиваются в красный цвет.
Напротив, некостные структуры, такие как отолиты, кажутся коричневыми черными. Цифровой анализ, проведенный для количественной оценки общей окрашенной площади, показал значительное уменьшение окрашенной площади для групп обработки ацетатом свинца на 10 и 20 миллиграммов на литр. Изменения в минерализации костей показали дозовую зависимость.
Для лучшего эффекта окрашивания и наблюдения важно удалить исходный пигмент личинок рыбок данио, а также удалить пузырьки после обесцвечивания.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании используется окрашивание ализариновым красным для демонстрации того, что воздействие ацетата свинца приводит к изменению массы костной ткани у личинок zebrafish. Этот метод может быть адаптирован для изучения потери костной массы, вызванной воздействием различных опасных токсикантов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Токсикология
- Биология развития
Теоретические основы
- Окрашивание ализариновым красным — это метод, используемый для визуализации скелетных структур.
- Danio rerio являются модельным организмом для изучения развития костной ткани и токсичности.
- Известно, что ацетат свинца оказывает токсическое воздействие на биологические системы.
- Остеопороз характеризуется снижением костной массы, что может быть смоделировано на zebrafish.
Цель исследования
- Оценить влияние ацетата свинца на массу костной ткани у личинок zebrafish.
- Разработать метод определения костной токсичности, вызванной химическими веществами.
- Облегчить сравнение изменений скелета между различными образцами.
Используемые методы
- Окрашивание фиксированной ткани zebrafish алызариновым красным.
- Фиксация личинок zebrafish в параформальдегиде и PBS.
- Промывка личинок Tris HCL или хлоридом магния.
- Процедуры обесцвечивания, описанные в рукописи.
Основные результаты
- Воздействие ацетата свинца привело к заметным изменениям массы костной ткани.
- Метод окрашивания обеспечил возможность постоянной фиксации изменений скелета.
- Результаты подтверждают возможность использования zebrafish в качестве модели для изучения остеопороза.
- Данная методология позволяет исследовать воздействие других опасных токсикантов.
Выводы
- Окрашивание алызариновым красным эффективно для оценки токсичности для костной ткани у zebrafish.
- Исследование подчеркивает потенциал zebrafish в токсикологических исследованиях.
- Дальнейшие исследования могут быть направлены на изучение воздействия различных токсикантов на здоровье костной ткани.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Этот метод позволяет на ранних стадиях выявлять химически индуцированную потерю костной ткани у личинок данио-рерио, что способствует механистическому снижению рисков в токсикологии и валидации мишеней для путей поддержания здоровья скелета. Путем количественного определения изменений минерализованной ткани с помощью окрашивания алызарином красным метод обеспечивает воспроизводимый, дозозависимый результат для оценки влияния соединений на минерализацию костей. Данный подход повышает прогностическую уверенность при оптимизации ведущих соединений и доклиническом скрининге безопасности веществ, воздействующих на костную ткань.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, связанные с минерализацией костей и целостностью скелета.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков, обеспечивая постоянную количественную регистрацию изменений скелета у различных образцов.
- Прогностическая ценность: облегчает отбор перспективных соединений в портфеле путем раннего выявления на этапе поиска веществ с дозозависимым влиянием на костную массу.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает количественные измерения окрашенной области на основе пороговых значений для объективного сравнения групп терапии.
- Практическая ценность: Стандартизирует протоколы подготовки образцов и визуализации для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости при использовании многолуночных форматов.
- Готовность анализа: Создает цифровые результаты, совместимые с анализом в ImageJ, что позволяет проводить высокопродуктивный скрининг фенотипов костной токсичности.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Моделирует релевантные для человека реакции скелета на воздействие токсикантов, что способствует согласованию трансляционных биомаркеров потери костной массы.
- Практическая ценность: Связывает этапы поиска и доклинических исследований, предоставляя консервативный анализ минерализации костей на базе позвоночных.
- Снижение рисков: Помогает принимать обоснованные решения о дальнейшем продвижении с учетом рисков, выявляя признаки потери костной массы до проведения исследований на млекопитающих.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум разработки лекарственных средств — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до оценки доклинической безопасности, особенно для соединений с потенциальными побочными эффектами на скелетную систему.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез о воздействии химических веществ на пути развития и минерализации костной ткани на модели позвоночных.
- Скрининг: позволяет стандартизировать анализ и получать количественные данные для выявления дозозависимых изменений площади окрашивания.
- Аналитика: предоставляет калиброванные измерения площади на основе пороговых значений, что позволяет проводить статистическое сравнение минерализации костей при различных условиях.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями путем моделирования консервативных скелетных реакций на токсиканты у личинок zebrafish.
- Корпоративное использование: создает многократно используемую платформу для скрининга различных библиотек химических соединений на предмет костной токсичности.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в путях, связанных с костной тканью.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость и масштабируемость благодаря стандартизированным этапам фиксации, окрашивания и цифрового количественного анализа.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет получения ранних количественных сигналов о склонности к потере костной массы.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков путем выявления рисков скелетной токсичности до осуществления значительных инвестиций.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с зебрани-данио, навыки проведения гистологических исследований, а также опыт флуоресцентной и колориметрической визуализации.
- Метод зависит от использования стереомикроскопа и программного обеспечения для анализа изображений (например, ImageJ) для обеспечения стандартизированного количественного анализа.
- Необходима межгрупповая стандартизация протоколов окрашивания и настроек пороговых значений для получения воспроизводимых результатов.
- При распространении метода на другие модельные системы или классы химических веществ, помимо ацетата свинца, требуются соответствующие адаптационные изменения.
- Метод ограничен необходимостью удаления пигмента и этапами осветления фона для обеспечения точного детектирования сигнала.
