ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Эта работа была поддержана NIH T32GM008440 (JH/EW) и NIH R01AI058106 (JH). Мы признаем ядро проточной цитометрии UCSF Parnassus (RRID: SCR_018206), частично поддерживаемое грантом NIH P30 DK063720 и грантом NIH S10 Instrumentation Grant S10 1S10OD021822-01.

<ol><li>Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelium+in+acute+lung+injury%2Facute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome.</a> Current Opinion Critical Care. 14 (1), 22-30 (2008).</li>
<li>Khakpour, S., Wilhelmsen, K., Hellman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+cell+Toll-like+receptor+pathways+in+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial cell Toll-like receptor pathways in sepsis.</a> Innate Immunity. 21 (8), 827-846 (2015).</li>
<li>Tuttolomondo, A., Daidone, M., Pinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction+and+inflammation+in+ischemic+stroke+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction and inflammation in ischemic stroke pathogenesis.</a> Current Pharmaceutical Design. 26 (34), 4209-4219 (2020).</li>
<li>Roberts, A. C., Porter, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+endothelial+dysfunction+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+and+Vascular+Disease+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of endothelial dysfunction in diabetes.</a> Diabetes and Vascular Disease Research. 10 (6), 472-482 (2013).</li>
<li>Widmer, R. J., Lerman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Cardiology+Science+and+Practice%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction and cardiovascular disease.</a> Global Cardiology Science and Practice. 2014 (3), 291-308 (2014).</li>
<li>Joffre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catecholaminergic+vasopressors+reduce+toll-like+receptor+agonist-induced+microvascular+endothelial+cell+permeability+but+not+cytokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Catecholaminergic vasopressors reduce toll-like receptor agonist-induced microvascular endothelial cell permeability but not cytokine production.</a> Critical Care Medicine. 49 (3), 315-326 (2021).</li>
<li>Yan, J., Nunn, A. D., Thomas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+induction+of+cell+adhesion+molecules+by+proinflammatory+mediators+in+human+cardiac+microvascular+endothelial+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Selective induction of cell adhesion molecules by proinflammatory mediators in human cardiac microvascular endothelial cells in culture.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 3 (4), 315-331 (2010).</li>
<li>Bouïs, D., Hospers, G. A., Meijer, C., Molema, G., Mulder, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium+in+vitro%3A+A+review+of+human+vascular+endothelial+cell+lines+for+blood+vessel-related+research%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Endothelium in vitro: A review of human vascular endothelial cell lines for blood vessel-related research.</a> Angiogenesis. 4 (2), 91-102 (2001).</li>
<li>Nolte, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+basic+conditions+are+essential+for+successful+siRNA+transfection+into+primary+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oligonucleotides%22%5BJournal%5D)">Optimized basic conditions are essential for successful siRNA transfection into primary endothelial cells.</a> Oligonucleotides. 19 (2), 141-150 (2009).</li>
<li>Auguste, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+release+of+siRNA+from+poly%28ethylene+glycol%29-protected%2C+pH-dependent+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Triggered release of siRNA from poly(ethylene glycol)-protected, pH-dependent liposomes.</a> Journal of Controlled Release. 130 (3), 266-274 (2008).</li>
<li>Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+mouse+vascular+endothelium.+In+vitro+studies+of+lymphatic%2C+large+blood+vessel+and+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Vessels%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells.</a> Blood Vessels. 24 (1-2), 11-23 (1987).</li>
<li>Alphonse, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+culture+of+endothelial+colony-forming+cells+from+human+and+rat+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The isolation and culture of endothelial colony-forming cells from human and rat lungs.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1697-1708 (2015).</li>
<li>Lim, Y. -C., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+murine+heart+and+lung+endothelial+cells+for+in+vitro+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems.</a> Methods in Molecular Biology. 341, 141-154 (2006).</li>
<li>Cao, G., Abraham, V., DeLisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicoly%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from mouse lung.</a> Current Protocols in Toxicoly. 61, 1-9 (2014).</li>
<li>Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Delisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+lung+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine lung endothelial cells.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 296 (6), 1096-1103 (2009).</li>
<li>Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+protocol+for+isolating+mouse+lung+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1458(2019).</li>
<li>Sutermaster, B. A., Darling, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+high-yield%2C+high-throughput+cell+enrichment%3A+fluorescence+versus+magnetic+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting.</a> Scientific Reports. 9 (1), 227(2019).</li>
<li>Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+cell-substrate+impedance+sensing+for+the+quantification+of+endothelial+proliferation%2C+barrier+function%2C+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51300(2014).</li>
<li>Wong, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK1%2F2+has+divergent+roles+in+lps-induced+microvascular+endothelial+cell+cytokine+production+and+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">ERK1/2 has divergent roles in lps-induced microvascular endothelial cell cytokine production and permeability.</a> Shock. 55 (3), 349-356 (2020).</li>
<li>Domm, W., Misra, R. S., O'Reilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affect+of+early+life+oxygen+exposure+on+proper+lung+development+and+response+to+respiratory+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Affect of early life oxygen exposure on proper lung development and response to respiratory viral infections.</a> Frontiers in Medicine (Lausanne). 2, 55(2015).</li>
<li>Jia, G., Aroor, A. R., Jia, C., Sowers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+senescence+in+aging-related+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell senescence in aging-related vascular dysfunction.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1865 (7), 1802-1809 (2019).</li>
<li>Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+responses+in+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial responses in sepsis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (3), 361-370 (2020).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+endothelium+in+severe+sepsis+and+multiple+organ+dysfunction+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome.</a> Blood. 101 (10), 3765-3777 (2003).</li>
</ol>

Авторам раскрывать нечего.

Этот простой протокол подходит для эндотелиальных клеток высокой чистоты из легких мышей. Хотя общее время от начала до конца составляет 7-10 дней, практическое время составляет около 3-4 часов. По сравнению с другими методами13,14,15,16 текущий протокол оптимизирован, сохраняя основные этапы без ущерба для выхода и чистоты.
Стоит отметить некоторые критические аспекты этого протокола. Во-первых, важно использовать новорожденных щенков, а не взрослых мышей. По нашему опыту, эндотелиальные клетки взрослых мышей размножаются не так легко, как клетки новорожденных щенков, и они легко заполонены клетками с веретенообразной морфологией, соответствующей фибробластам или мезенхимальным стволовым клеткам15,16. Одно из возможных объяснений этой разницы заключается в том, что развитие легких происходит на альвеолярной стадии у новорожденных мышей, характеризующейся более быстрой пролиферацией эндотелиальных клеток20. Также может быть некоторая степень старения с возрастом21 год. Время ферментативного переваривания также должно быть точным, так как недостаточное переваривание может привести к низкому выходу одноклеточной суспензии. Напротив, чрезмерное переваривание может привести к значительной гибели клеток. Мы определили, что оптимальное время для переваривания коллагеназы составляет 45 минут. Затем следует механическая диссоциация тупой канюлей. Также сообщалось о закапывании интратрахеальной коллагеназы во время ферментативного пищеварения14,15; Однако это может занять много времени и привести к неполному перевариванию во время текущей работы. Наконец, некоторые протоколы переходят непосредственно к выделению иммуногранул сразу после ферментативного переваривания13,16. Мы обнаружили, что культивирование клеток из диссоциированного легкого в среде в течение дня или двух перед отбором иммуногранул существенно увеличивает выход жизнеспособных и высокочистых эндотелиальных клеток. Это может быть связано со скоростью попадания изолированных клеток в среду для культивирования тканей, что приводит к меньшей гибели клеток на ранних стадиях после удаления у мышей, более высокой начальной плотности посева и времени для прилипания и размножения эндотелиальных клеток до первого выделения иммуногранул.
Ограничения препарата и анализа эндотелиальных клеток мыши заключаются в следующем. Каждая мышь предоставляет только ограниченное количество ячеек, которые необходимо использовать в течение нескольких проходов. Эту проблему можно преодолеть, объединив легочный дайджест от нескольких мышей. К сожалению, мы безуспешно пытаемся криоконсервировать и разморозить клетки для будущего использования. Несмотря на эти ограничения, эндотелиальные клетки мыши имеют некоторые преимущества. Они могут быть полезны, особенно в ситуациях, когда эндотелиальные клетки человека либо не могут быть использованы (например, нокаут генов), когда требуются дополнительные исследования для подтверждения результатов с клетками человека, либо когда гетерогенность ответов эндотелиальных клеток от разных доноров человека делает воспроизводимость между экспериментами проблематичной6. Гомогенная популяция эндотелиальных клеток генетически идентичных мышей обеспечивает воспроизводимость между экспериментами и изучением конкретных генов и путей в стабильных фоновых условиях.
Эндотелиальные клетки мыши можно использовать для различных применений, чтобы дать представление об активации эндотелия и дисфункции при различных процессах заболевания. Например, эндотелиальные клетки играют неотъемлемую роль в сепсисе, способствуя как полезным, так и патологическим реакциям благодаря своей роли в активации локализованного и системного воспаления, стимулировании транспорта и активации лейкоцитов в тканях, регулировании коагуляции и модуляции проницаемости эндотелия 2,22,23. Этот простой протокол обеспечивает жизнеспособные, функциональные эндотелиальные клетки, которые могут быть использованы в анализах для каждого из этих эндотелиальных процессов.

Интерес к изучению эндотелия сосудов возрос в последнее время, так как дисфункция микрососудистых эндотелиальных клеток возникает при множественных заболеваниях человека, таких как инсульт, сердечно-сосудистые заболевания, диабет, острое повреждение легких, сепсис и неинфекционные повреждения 1,2,3,4,5. Чтобы определить патогенез этих состояний и понять роль специфических генов в защитных и нерегулируемых реакциях эндотелиальных клеток, необходимы надежные методы выделения и культивирования микрососудистых эндотелиальных клеток высокой чистоты у мышей. В то время как во многих исследованиях используются эндотелиальные клетки человека, такие как эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) или микрососудистые эндотелиальные клетки легких человека (HMVEC), существует множество причин для использования эндотелиальных клеток мыши для изучения функции эндотелия и дисфункции. Во-первых, существует значительная гетерогенность в ответах эндотелиальных клеток от разных доноров человека, что приводит к вариабельности результатов между отдельными экспериментами 6,7,8. Во-вторых, подавление генов-мишеней в первичных клеточных линиях человека также может привести к вариабельным уровням экспрессии белка 9,10. Напротив, существует минимальная гетерогенность в ответах эндотелиальных клетокмыши 11, предполагая, что генетический фон одинаков между исследуемыми группами. Кроме того, большое количество эндотелиальных клеток мыши может быть получено путем объединения легких нескольких новорожденных мышей. Эти факторы позволяют получить более последовательные и воспроизводимые результаты между экспериментами. Наконец, наличие нокаутных или трансгенных мышей также обеспечивает изоляцию типов клеток, в которых отсутствуют интересующие белки.
Значительные проблемы с выделением здоровых и чистых популяций эндотелиальных клеток легких мышей с использованием опубликованных методов 12,13,14,15,16 привели к разработке более надежного и простого метода выделения высококачественных микрососудистых эндотелиальных клеток легких мыши. Преимущества текущего протокола включают использование неонатальных мышей, которые легко доступны, ограничивая расходы на животноводство и содержание. Кроме того, по нашему опыту, жизнеспособность эндотелиальных клеток новорожденных мышей значительно выше, чем эндотелиальных клеток, полученных от взрослых мышей. Поскольку новорожденные мыши имеют маленькую легочную ткань, эндотелиальные клетки могут быть собраны путем переваривания иссеченных легких в коллагеназу, а не с помощью трахеальной инстилляции коллагеназы, которая рекомендуется для сбора у взрослых мышей16. Это также сокращает время между эвтаназией мышей и попаданием их эндотелиальных клеток в питательные среды и инкубатор, не влияя на чистоту, выход или воспроизводимость эндотелиальных реакций. Наконец, чистые клеточные популяции были выделены без проточной цитометрии, что может повредить или привести к снижению выхода эндотелиальных клеток14,15,17.
Текущий модифицированный протокол последовательно приводит к высокой чистоте и жизнеспособным эндотелиальным клеткам за 7-10 дней, которые могут быть немедленно использованы для экспериментов in vitro . Выделение клеток непосредственно от нокаутированных животных также сводит к минимуму манипуляции с клетками перед экспериментами. Эти методы могут быть использованы для изучения роли различных белков в функции эндотелия, чтобы обнаружить терапевтические мишени на основе эндотелия для множественных заболеваний.

<table><tbody><tr><td>50 мл конические иглы</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Accutase Cell Unit</td><td>Innovative Cell Technologies, Inc</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8"</td><td>Becton Disckinson</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>BioRender.com</td><td>BioRender</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blunt Canjula 15 G x 1-1/2"</td><td>Covidien</td><td>8881202314</td><td></td></tr><tr><td>CD-102 Rat anti-mouse (3C4 (MIC2/4))BD</td> <td>Biosciences</td><td>553326</td><td></td></tr><tr><td>CD-31 Rat anti-mouse (MEC 13.3)</td><td>BD Biosciences</td><td>557355</td><td></td></tr><tr><td>коллагеназа, тип 1</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>LS004194</td><td></td></tr><tr><td>DMEM,</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG</td><td>Invitrogen</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>Поддержка роста эндотелиальных клеток</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>02-102</td><td></td></tr><tr><td>Фильтры для клеток Falcon (70 &; m)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Фетальная сыворотка крупного рогатого скота, термоинактивированная</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Тонкие ножницы</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Тонкие ножницы</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Одноразовое боросиликатное стекло Пастер Пипец</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-mouse CD102 (3C4)</td><td>BD Biosciences</td><td>557444</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat IgG2a,&nbsp; &kappa; Контроль изотипа (R35-95)</td><td>BD Biosciences</td><td>553929</td><td></td></tr><tr><td>щипцами Graefe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, без кальция, без магния, без фенола красный</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>гепарина натрия для инъекций (1,000 единиц/мл)</td><td>Medline</td><td>0409-2720-02</td><td></td></tr><tr><td>Гепариновая натриевая соль из слизистой оболочки кишечника свиньи</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>заменимые аминокислоты (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>PE Rat Anti-mouse CD31 (MEC 13.3)</td><td>BD Biosciences</td><td>553373</td><td></td></tr><tr><td>PE Rat IgG2a,&nbsp; &kappa; &nbsp; Контроль изотипа R35-95)</td><td>BD Biosciences</td><td>553930</td><td></td></tr><tr><td>Пенициллин стрептомицин (10 000 Ед/мл, 10 000 &; g/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>рекомбинантный мышиный ИФН-&гамма;</td><td>Peprotech</td><td>315-05</td><td></td></tr><tr><td>Мышиный рекомбинантный IL-1&бета;</td><td>Peprotech</td><td>211-11B</td><td></td></tr><tr><td>Рекомбинантный мышиный TNF-&alpha;</td><td>Peprotech</td><td>315-01A</td><td></td></tr><tr><td>Пробирки из полистирола с круглым дном</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Semken Щипцы</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>Пируват натрия (100 мМ)</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Stericup Quick Release-GP Стерильная система вакуумной фильтрации, 250 мл</td><td>миллипоры</td><td>S2GPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP Стерильная центрифужная трубка Верхний фильтрующий блок</td><td>Milipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Стерильный шприц (10 мл)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-459</td><td></td></tr><tr><td>Стерильный шприц (20 мл)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-460</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Колба для клеточных культур с вентиляционной крышкой, обработанная CellBIND</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3290</td><td></td></tr></tbody></table>

Выделение первичных эндотелиальных клеток легких мыши

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

Эндотелиальные клетки играют решающую роль в регуляции сосудистого тонуса, иммунитета, коагуляции и проницаемости. Эндотелиальная дисфункция возникает при таких заболеваниях, как диабет, атеросклероз, сепсис и острое повреждение легких. Надежный и воспроизводимый метод выделения чистых эндотелиальных клеток у мышей необходим для исследования роли эндотелиальных клеток в патогенезе этих и других состояний. В этом протоколе микрососудистые эндотелиальные клетки легких были получены от 5-7-дневных новорожденных мышей. Легкие собирают, измельчают и ферментативно переваривают с помощью коллагеназы I, а высвобожденные клетки культивируют в течение ночи. Затем эндотелиальные клетки отбираются с использованием анти-PECAM1 (CD-31) IgG, конъюгированного с магнитными шариками, и клетки снова культивируются до слияния. Затем происходит вторичный отбор клеток с помощью анти-ICAM2 (CD-102) IgG, конъюгированного с магнитными шариками, чтобы повысить чистоту эндотелиальных клеток, и клетки снова культивируются до слияния. Весь процесс занимает примерно 7-10 дней, прежде чем клетки можно будет использовать для экспериментов. Этот простой протокол дает высокочистые (чистота >92%) эндотелиальные клетки, которые могут быть немедленно использованы для исследований in vitro , включая исследования, посвященные выработке эндотелиальных цитокинов и хемокинов, лейкоцитарно-эндотелиальным взаимодействиям, путям эндотелиальной коагуляции и проницаемости эндотелия. При наличии множества нокаутов и трансгенных линий мышей эта процедура также позволяет понять функцию специфических генов, экспрессируемых эндотелиальными клетками, в здоровых и патологических реакциях на травму, инфекцию и воспаление.

Этот простой протокол позволяет выделять, культивировать и характеризовать микрососудистые эндотелиальные клетки мыши в течение 7-10 дней (рис. 1). Вкратце, легкие иссекаются и ферментативно перевариваются перед покрытием. Сразу после нанесения покрытия эндотелиальные клетки и другие клетки будут плавать в средах для культивирования клеток. К следующему дню эндотелиальные клетки и загрязняющие клетки будут приклеены к пластине, и для удаления мусора и плавающих клеток потребуется энергичная техника промывки. Как только клетки достигают слияния, выполняется первый отбор иммуногранул. Затем CD-31-положительные клетки начинают расти в булыжном образовании (рис. 2). Клетки, которые не имеют морфологии булыжника или разрастаются, являются загрязнителями, а не эндотелиальными клетками13,14,15,16.
Затем проводится второй отбор иммуногранул с использованием шариков с покрытием против CD-102 для повышения чистоты эндотелиальных клеток, аналогично другим протоколам13,16. Клетки, которые выросли до слияния после второго отбора иммуногранул, затем могут быть использованы для экспериментов. Флуоресцентно-активируемая сортировка клеток (FACS) используется для подтверждения того, что клеточная популяция является CD-31- и CD-102-положительной (рис. 3).
Эти эндотелиальные клетки затем могут быть использованы для многих применений, таких как изучение воспалительных путей эндотелия и функции эндотелиального барьера. Например, было замечено, что лечение мышиным цитомиксом (IFNg, TNFa и IL1b, каждый в дозе 10 нг / мл) индуцировало продукцию IL-6 эндотелиальными клетками (рис. 4A). Затем для измерения трансэндотелиального сопротивления (TER) к потоку электрического тока через монослои эндотелиальных клеток легких мышей использовали Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS)18 . Было замечено, что клетки, обработанные цитомиксом, приводили к снижению TER (рис. 4B), что согласуется с повышенной проницаемостью эндотелия. Эти примеры иллюстрируют, как эндотелиальные клетки, полученные с использованием этого протокола, могут изучать различные эндотелиальные процессы. Это позволяет исследователям легче изучать гены, представляющие интерес в эндотелиальных клетках, учитывая постоянно растущее число доступных нокаутных и трансгенных мышей.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63253/63253fig01.jpg"> Рисунок 1: Схема выделения эндотелиальных клеток легких мышей. Легкие 5-7-дневных новорожденных щенков собирают и измельчают. Измельченную ткань ферментативно расщепляют с помощью коллагеназы I. Клеточную суспензию покрывают и культивируют в течение 2-3 дней. Затем клетки подвергаются первичной изоляции иммуногранул с шариками, покрытыми CD-31, и культивируются еще 3-4 дня. Второе выделение иммуногранул с шариками, покрытыми CD-102, перед культивированием еще 2-3 дня. Теперь клетки готовы к функциональным экспериментам. Изображение было создано с помощью веб-инструмента для создания иллюстраций Biorender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63253/63253fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63253/63253fig02.jpg"> Рисунок 2: Морфология эндотелиальных клеток легких мышей. Культивируемые мышиные эндотелиальные клетки легких демонстрируют булыжную морфологию. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63253/63253fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63253/63253fig03v2.jpg"> Рисунок 3: Анализ эндотелиальных клеток методом проточной цитометрии. (A) Все события визуализируются на точечной диаграмме прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC). (B) Точечная диаграмма подтверждает положительный результат эндотелиальных клеток легких мышей как на эндотелиально-специфические клеточные поверхностные антигены CD-31, так и на CD-102. (C) Гистограмма образца изотипа и образца, окрашенного специфическим антителом CD-31/CD-102. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63253/63253fig03largev2.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63253/63253fig04.jpg"> Рисунок 4: Цитомикс индуцирует выработку IL-6 эндотелиальными клетками легких у мышей и проницаемость эндотелиальных клеток. Мышиные микрососудистые эндотелиальные клетки легких от мышей C57BL / 6 обрабатывали цитомиксом (IFNg, TNFa и IL1b, каждый в дозе 10 нг / мл). (A) Затем уровни IL-6 количественно определяли в культуральных супернатантах через 15 ч (**p&lt;0,01, n = 4 лунки/состояние). (B) Для многократного измерения трансэндотелиального сопротивления (TER) в течение 15 часов использовалось электрическое измерение импеданса клетки-субстрата. Данные были нормализованы к резистентности непосредственно перед добавлением цитомикса в соответствии с назначением и были проанализированы с помощью двустороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом Тьюки19 (**p&lt;0,01, n = 4 лунки / состояние). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63253/63253fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

В этой статье первичные эндотелиальные клетки легких были выделены и культивированы у новорожденных мышей.

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

Протокол демонстрирует надежный и воспроизводимый метод выделения и культивирования эндотелиальных клеток высокой чистоты у мышей, который может иметь несколько применений. Этот метод является более простым методом, который сохраняет выход и чистоту эндотелиальных клеток. Продемонстрирует процедуру Нина Нгуен, штатный научный сотрудник моей лаборатории.Для начала покрутите магнитные шарики в течение нескольких секунд. Пипетка 50 микролитров шариков в две 1,5-миллилитровые микроцентрифужные пробирки для CD31 и CD102. Добавьте один миллилитр буфера для промывки шариков и хорошо перемешайте.Поместите пробирки на магнитный сепаратор и удалите надосадочную жидкость стеклянной пипеткой Пастера. Ресуспендируйте шарики в 50 микролитрах буфера для промывки шариков. Затем добавьте пять микролитров или 2,5 микрограмма антител CD31 или CD102 к каждым 50 микролитрам шариков.Инкубируйте суспензию шариков с легким вращением на концевом вращателе в течение ночи при четырех градусах Цельсия или в течение трех часов при комнатной температуре. Промойте иммуношарики четыре раза, а затем ресуспендируйте иммуношарики в 50 микролитрах буфера для промывки шариков. В день изоляции добавьте 25 миллилитров HBSS к 25 миллиграммам коллагеназы первого типа и инкубируйте его с осторожной ротацией.Затем отфильтруйте с помощью 22-микрометрового фильтра. После эвтаназии пяти-семидневного детеныша мыши опрыскайте тушу 70% этанолом. Затем разрежьте диафрагму вверх вдоль всех боковых стенок грудной клетки, чтобы обнажить грудную полость.Введите пять миллилитров холодного DMEM в правый желудочек сердца, пока легкие не побелеют. Затем разрежьте доли дистальнее соответствующих бронхов один за другим, чтобы удалить легкие. Вытяните доли легких в коническую трубку объемом 50 миллилитров, предварительно заполненную 20 миллилитрами ледяной базальной среды.Осторожно помешивайте трубку вручную в течение 10-15 секунд, чтобы смыть лишние эритроциты. Извлеките легкие из среды с помощью клеточного ситечка и пропустите через мясорубку стерилизованными ножницами. Переложите измельченную ткань в коническую трубку объемом 50 миллилитров с 25 миллилитрами предварительно подогретого раствора коллагеназы.Аккуратно перемешайте на вращающемся миксере. Присоедините шприц объемом 20 миллилитров к тупой канюле 15-го калибра и энергично растирайте суспензию, не вспенивая от 10 до 15 раз в клеточную суспензию. Отфильтруйте суспензию через 70-микрометровый сетчатый фильтр в коническую трубку объемом 50 миллилитров.Затем промойте коническую трубку, используемую для пищеварения, и клеточное ситечко 15 миллилитрами базальной среды. Центрифугируйте клеточную суспензию в 400 раз G в течение восьми минут при четырех градусах Цельсия. Ресуспендируйте гранулы в двух миллилитрах полной среды.Добавьте восемь миллилитров полной среды и инкубируйте ее. На следующий день дважды промойте колбы 10 миллилитрами HBSS без кальция и магния и добавьте 10 миллилитров готовой среды. Как только клетки сливаются на 90-95%, они готовы к первичному выделению иммуногранул.Дважды промойте прилипшие эндотелиальные клетки 10 миллилитрами HBSS без кальция и магния. Добавьте два миллилитра раствора для отслоения клеток, не содержащего трипсина, и инкубируйте его, чтобы обеспечить подъем всех клеток из колбы. Добавьте восемь миллилитров базальной среды.Затем раскрутите клетки до 400 раз G в течение четырех минут при комнатной температуре и ресуспендируйте их в двух миллилитрах базальной среды. Шарики с вихревым покрытием против CD31 в течение нескольких секунд, чтобы ресуспендировать бусины. Добавьте 30 микролитров шариков на каждые два миллилитра клеточной суспензии и закрепите крышку.Инкубируйте пробирку в течение 10 минут при комнатной температуре на торцевом вращателе. Затем поместите трубки на магнитный сепаратор на две минуты. Аспирируйте надосадочную жидкость и извлеките трубку из магнита.Ресуспендируйте гранулу шариковой ячейки, добавив три миллилитра базальной среды в трубку и несколько раз пипетируя вверх и вниз. Замените трубку на магнитном сепараторе на две минуты. Затем тщательно аспирируйте надосадочную жидкость с помощью стеклянной пастеровской пипетки.После окончательной промывки, когда надосадочная жидкость станет прозрачной, ресуспендируйте гранулу шариковой ячейки в трех миллилитрах полной питательной среды и перенесите ее в колбу T75. Добавьте семь миллилитров полной питательной среды и инкубируйте ее. На следующий день повторно промыть клетки HBSS без кальция и магния.Затем добавьте 10 миллилитров полной среды. Как только клетки сливаются на 90-95%, они готовы к вторичному выделению иммуногранул. Первый отбор иммуногранул идентифицирует CD31-положительные клетки, которые растут в булыжном образовании.Второй выбор иммуногранул с шариками, покрытыми анти-CD102, увеличивает чистоту эндотелиальных клеток, а сортировка клеток, активированная флуоресценцией, используется для подтверждения того, что клеточная популяция является CD31-положительной и CD102-положительной. Для изучения воспалительных путей эндотелия и функции эндотелиального барьера лечение мышиным цитомиксом использовалось для индукции значительной продукции IL-6 эндотелиальными клетками со значением P менее 0,01. Кроме того, трансэндотелиальное сопротивление уменьшилось, показывая повышенную проницаемость эндотелия.Изолированные эндотелиальные клетки могут быть использованы для стимуляции эндотелиальных клеток или анализов барьерной функции для обнаружения терапевтических мишеней на основе эндотелия для нарушений эндотелиальной дисфункции.

isolation-of-primary-mouse-lung-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Иммунология и инфекции

Здесь мы опишем протокол для изоляции и культуре мышиных легочных эндотелиальных клеток. Этот метод включает в себя механические и ферментативной диссоциации легочной ткани, а также 2-х ступенчатый процесс очистки с использованием анти-PECAM-1 и анти-ICAM-2 антител, конъюгированных с магнитных бус, который производит чистый эндотелиальной клеточной популяции в основном микрососудистых происхождения.

Выделение и культуре эндотелиальных клеток легочной от новорожденных мышей

Высоко очищенного препарата мышиные клетки легких дендритных описано. Особое внимание уделяется изоляции обычных дендритных подмножество клеток.

Выделение мышиные клетки легких Дендритные

Микрососудистые эндотелиальные клетки головного мозга (BMEC) связаны между собой специфическими соединительными белками, образующими высокорегулируемый барьер, разделяющий кровь и центральную нервную систему (ЦНС), так называемый гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Выделение первичных микрососудистых эндотелиальных клеток головного мозга мышей, как описано в данном протоколе, позволяет проводить детальные исследования ГЭБ in vitro.

Выделение Первичная мышиный Brain Микрососудистой эндотелиальных клеток

Эндотелиальные клетки сосудов играют важную роль во многих важных сердечно-сосудистых заболеваниях. В этой статье описан простой метод выделения и расширения эндотелиальных клеток из аорты мыши без использования какого-либо специального оборудования. Наш протокол предоставляет эффективные средства выявления механизмов в физиопатологии эндотелиальных клеток.

Выделение и первичной культуре мышиных эндотелиальных клеток аорты

Этот протокол подготовлен для того, чтобы поделиться нашим методом выделения коронарных эндотелиальных клеток мышей с целью визуализации или проведения молекулярно-биологических экспериментов.

Выделение мыши ишемическая эндотелиальных клеток

Микроваскулярная эндотелиальных клеток скелетных мышц (MMEC) форма внутренней стенки капилляров мышц и регулировать так, обмен жидкости/молекул и миграции клеток (иммунитет) между мышечной ткани и крови. Изоляция первичного мышиных MMEC, как описано здесь, позволяет всеобъемлющего в пробирке исследования группы «myovascular».

Изоляция микрососудистой эндотелиальных клеток первичного мышиных скелетных мышц

Здесь мы описываем и демонстрируем протокол первичной изоляции синусоидальных эндотелиальных клеток печени мыши (LSEC). Протокол основан на перфузии коллагеназы печени, непаренхимальной очистке клеток низкоскоростной центрифугированием и выборе магнитных шариков CD146. Мы также фенотипируем и характеризуем эти изолированные ЛСЭК с помощью проточной цитометрии и сканирующей электронной микроскопии.

Выделение и характеристика первичных синусоидальных эндотелиальных клеток печени мыши

Несмотря на сложную задачу, выделение эндотелиальных клеток легких имеет важное значение для исследований воспаления легких. В настоящем протоколе описана процедура выделения макрососудистых и микрососудистых эндотелиальных клеток с высоким выходом и высокой чистотой.

Выделение и очистка микрососудистых и макрососудистых эндотелиальных клеток из образцов, полученных из легких

Этот протокол описывает выделение эндотелиальных клеток мыши из целой поджелудочной железы.

Выделение эндотелиальных клеток поджелудочной железы мыши

В этом протоколе подробно описывается выделение живых иммунных и неиммунных популяций из легких мышей в стабильном состоянии и после гриппозной инфекции. Он также предоставляет стратегии гейтинга для идентификации субпопуляций эпителиальных и миелоидных клеток.

Выделение живых популяций миелоидных и эпителиальных клеток из легкого мыши

Узнайте надёжный метод выделения первичных эндотелиальных клеток лёгких мыши с высокой чистотой с помощью иммуномагнитной селекции. Этот протокол сохраняет выход и чистоту клеток для исследований сосудистой биологии.

Выделение первичных эндотелиальных клеток легких мыши

Больше видео