Функциональная оценка кинезина-7 CENP-E в сперматоцитах с использованием ингибирования, иммунофлюоресценции и проточной цитометрии in vivo

Мейоз является эволюционно консервативным событием у эукариот, которое необходимо для гаметогенеза и полового размножения. Наш протокол предоставляет эффективный метод исследования мейотического деления и сперматогенеза. Мы описали ряд протоколов анализа сперматоцитов.

Этот метод может быть применен для наблюдения мейотического веретена, гомологичных хромосом и субклеточных органелл в сперматоцитах. Этот метод может быть использован для анализа мейотического деления, генерации моделей животных для редактирования генов и трансфекции генов в тканях или органах. Экспериментаторы должны поддерживать стерильную среду во время операции на брюшной полости и обращать внимание на температуру, время и ключевые условия эксперимента этого протокола.

Продемонстрировать процедуру будет госпожа Мэн-Фэй Сюй, аспирантка моей лаборатории. Начните построение GSK923295 опосредованной модели мыши с ингибированием центромерного белка E или CENP-E, связав обезболиваемые конечности мыши и закрепив их на восковом лотке. После дезинфекции хирургической области используйте стерильный скальпель, чтобы сделать отверстие в пять миллиметров в брюшной полости мыши, а затем поместить стерильные хирургические зажимы на кожу.

Затем потяните жировую подушечку придатка яичка стерильными рассекающими щипцами, чтобы найти яички с помощью стерильного пинцета. После фиксации яичек стерильными щипцами под стереоскопом медленно вводят 10 микролитров GSK923295 в семенные канальцы в конечной концентрации 10 мкмоль, используя 10 микролитров йода. Когда закончите, вставьте яички обратно в брюшную полость и зашите место операции, как описано в текстовой рукописи.

Для градиентного обезвоживания собранных яичек мыши последовательно инкубируют образец в различных средах, как описано в рукописи. После серийной инкубации поместите ткань на дно встраиваемой коробки и добавьте в коробку расплавленный парафин. Для полного застывания парафина охладите образцы при четырех градусах Цельсия в течение шести часов.

Позже закрепите образец на держателе ультрамикротома, сохраняя угол между образцом и поверхностью ножа от 5 до 10 градусов. Отрегулируйте толщину среза до пяти микрометров, чтобы подготовить срезы толщиной пять микрометров с помощью ультрамикротома. После приготовления распределите предметное стекло на водяной бане при температуре 40 градусов Цельсия перед сушкой секций в сушилке для предметного стекла в течение 12 часов при температуре 37 градусов Цельсия.

Через 12 часов выполните последовательную инкубацию слайдов, как описано ранее. Затем промойте предметные стекла в дистиллированной воде в течение пяти минут, а затем окрашивайте раствором гематоксилина Майера в течение шести минут при комнатной температуре. Затем промойте испачканные предметные стекла в проточной воде в течение пяти минут и выдержите в дистиллированной воде в течение двух минут.

Инкубируйте предметные стекла в 1% гидрохлориде этанола в течение трех секунд, а затем промойте в проточной воде в течение двух минут. Окрашивают образец 1%-ным эозином в течение 15 секунд с последующей серийной инкубацией. Когда закончите, запечатайте предметные стекла, используя 15 микролитров нейтральной жевательной резинки и покровное стекло размером 24 на 50 миллиметров.

Для иммунофлуоресценции поместите предметное стекло в раствор для извлечения антигена, чтобы он закипел под высоким давлением в скороварке на четыре минуты для извлечения антигена. Затем охладите предметное стекло естественным путем до комнатной температуры, а затем дважды ополосните дистиллированной водой в течение пяти минут и PBS в течение пяти минут. Чтобы проникнуть в клетки, инкубируйте предметное стекло в 500 микролитрах 0,25% Triton X-100 в PBS в течение 10 минут, а затем промойте предметные стекла PBS в течение пяти минут три раза.

Для блокирования антигена инкубируйте образец с 300 микролитрами 3%-ного бычьего сывороточного альбумина или BSA в течение одного часа и с первичными антителами в 3%BSA в PBST в течение 16 часов при четырех градусах Цельсия. После инкубации поместите предметное стекло в увлажненный ящик, чтобы предотвратить пересыхание тканей. Разогрейте горки естественным путем до комнатной температуры в течение 30 минут.

Выбросьте первичное антитело, а затем трижды промывайте предметное стекло в PBST в течение пяти минут. Разбавляют вторичные антитела 3%-ным содержанием BSA и PBST. Затем инкубируйте образец с разбавленными вторичными антителами в течение одного-двух часов при температуре 37 градусов Цельсия.

После промывки образца в PBST в течение пяти минут пять раз окрашивайте ядра 50 микролитрами DAPI в течение пяти минут при комнатной температуре. Установите защитное стекло с помощью монтажного носителя с защитой от выцветания и запечатайте покровное стекло лаком для ногтей. Для проточной цитометрии соберите семенники мыши в шестисантиметровые чашки Петри и разрежьте яички на кусочки размером в один кубический миллиметр с помощью хирургических ножниц.

Затем переварите яички в одном миллилитре 1% коллагеназы в центрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитра в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Чтобы осаждать сперматогенные клетки, центрифугируйте образец при 1000 г в течение пяти минут и выбросьте надосадочную жидкость перед добавлением одного миллилитра 0,25% раствора трипсина ЭДТА в образец в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия. Позже центрифугируют образец при 1 000 G в течение пяти минут.

Откажитесь от надосадочной жидкости, чтобы инкубировать осажденные клетки с одним миллилитром 70% холодного этанола в течение более восьми часов при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования при 1 000 г в течение пяти минут соберите клеточный осадок и окрашивайте сперматогенные клетки 500 микролитрами йодида пропидия или раствором для окрашивания PI при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут. После инкубации отфильтруйте образец с помощью сетки 300 меш, чтобы удалить клеточный мусор, и соберите клетки в проточную трубку для хранения клеток при четырех градусах Цельсия.

Обнаружение сигналов флуоресценции и рассеяния света на длине волны возбуждения на расстоянии 488 нанометров с помощью проточного цитометра. Проанализируйте содержание ДНК в образце и светорассеяние с помощью программного обеспечения ModFit MF LT 32. После инъекции яичек GSK923295 сперматогенная волна была изменена в семенных канальцах из-за ингибирования CENP-E.

Однако сперматогенная волна в семенных канальцах была регулярной и организованной в контрольной группе. Было замечено, что несколько гомологичных хромосом не были выровнены на экваториальной пластинке после ингибирования CENP-E. Кроме того, ингибирование CENP-E приводило к увеличению метафазных сперматоцитов I в семенных канальцах.

Иммунофлуоресцентный анализ продемонстрировал снижение количества трех или SYCP3-положительных клеток антисинаптонемного комплекса на семенной канальце после ингибирования CENP-E. С другой стороны, точки SYP3 на метафазную клетку и растяжения SYP3 на клетку не были затронуты в GSK92395 группах. Расстояния между полюсами веретена в метафазных сперматоцитах I были увеличены за счет ингибирования CENP-E.

Репрезентативный анализ показывает, что ингибирование CENP-E привело к уменьшению гаплоидных клеток в группе GSK 923295 по сравнению с контролем. Соотношение диплоидных клеток и клеток анеуплоидии не подвергалось существенному влиянию после ингибирования CENP-E. И наоборот, соотношение тетраплоидных клеток увеличилось в GSK923295 группе, чем в контрольной группе.

Анализ сперматогенных клеток с помощью просвечивающей электронной микроскопии показал нарушенную организацию сперматогенных клеток в GSK923295 группе. Экспериментатор должен обращать внимание на положение инъекции, дозу препарата, метод инъекции и метод наложения швов во время операции на брюшной полости и инъекции яичек. Этот метод вместе с электропорацией in vivo, ориентированной на целевые белки и инструменты редактирования генов, может быть использован в области миотического деления и сперматогенеза.